Fluorescens kvantitativ PCR (også kjent som TaqMan PCR, heretter referert til som FQ-PCR) er en ny kvantitativ nukleinsyreteknologi utviklet av PE (Perkin Elmer) i USA i 1995. Denne teknologien er basert på konvensjonell PCR ved å tilsette fluorescerende merkede prober.Sammenlignet med fleksibel PCR har FQ-PCR mange fordeler for å realisere sin kvantitative funksjon.Denne artikkelen har til hensikt å kort beskrive egenskapene, prinsippene, metodene og anvendelsene til teknologien.
1 Funksjoner
FQ-PCR har ikke bare den høye følsomheten til vanlig PCR, men også på grunn av bruken av fluorescerende prober, kan den direkte oppdage endringen av fluorescerende signal under PCR-amplifisering gjennom det fotoelektriske ledningssystemet for å oppnå kvantitative resultater, som overvinner mange mangler ved konvensjonell PCR, så den har også den høye spesifisiteten til DNA-hybridisering og høy spesifisitet.
For eksempel må generelle PCR-produkter observeres ved agarosegelelektroforese og etidiumbromidfarging med ultrafiolett lys eller ved polyakrylamidgelelektroforese og sølvfarging.Dette krever ikke bare flere instrumenter, men tar også tid og krefter.Flekkene som brukes Ethidiumbromid er skadelige for menneskekroppen, og disse kompliserte eksperimentelle prosedyrene gir muligheter for forurensning og falske positiver.Imidlertid trenger FQ-PCR bare å åpne lokket én gang under prøvelasting, og den påfølgende prosessen er fullstendig lukket røroperasjon, som ikke krever PCR-etterbehandling, og unngår mange ulemper ved konvensjonelle PCR-operasjoner.Eksperimentet bruker generelt ABI7100 PCR termisk syklus utviklet av PE-selskapet.
Instrumentet har følgende egenskaper: ① Bredt bruksområde: Det kan brukes til DNA- og RNA PCR-produktkvantifisering, genuttrykksforskning, patogendeteksjon og optimalisering av PCR-forhold.② Unikt kvantitativt prinsipp: Ved bruk av fluorescensmerkede prober vil mengden fluorescens akkumuleres med PCR-syklusen etter lasereksitasjon, for å oppnå formålet med kvantifisering.③ Høy arbeidseffektivitet: Innebygd 9600 PCR termisk syklus, datamaskinstyrt 1 til 2 timer for å fullføre forsterkning og kvantifisering av 96 prøver automatisk og synkront.④ Ikke behov for gelelektroforese: Ingen grunn til å fortynne og elektroforese prøven, bare bruk en spesiell sonde for å oppdage direkte i reaksjonsrøret.⑤Ingen forurensning i rørledningen: Det unike fullstendig lukkede reaksjonsrøret og det fotoelektriske ledningssystemet er tatt i bruk, så det er ingen grunn til å bekymre seg for forurensning.⑥Resultatene er reproduserbare: det kvantitative dynamiske området er opptil fem størrelsesordener.Derfor, siden denne teknologien ble utviklet med suksess, har den blitt verdsatt av mange vitenskapelige forskere og har blitt brukt på mange felt.
2 Prinsipper og metoder
Arbeidsprinsippet til FQ-PCR er å bruke 5′→3′ eksonukleaseaktiviteten til Taq-enzymet for å legge til en fluorescerende merket probe til PCR-reaksjonssystemet.Proben kan spesifikt hybridisere med DNA-malen inneholdt i primersekvensen.5'-enden av proben er merket med fluorescensemisjonsgenet FAM (6-karboksyfluorescein, fluorescensemisjonstopp ved 518 nm), og 3'-enden er merket med fluorescensslukkingsgruppen TAMRA (6-karboksytetrametylfluorescens ved 5-karboksytetrametylfluorescens, 3'-fluorescens ved 5'2'en), ginning av proben fosforyleres for å forhindre at proben forlenges under PCR-amplifisering.Når proben forblir intakt, undertrykker quencher-gruppen fluorescensemisjonen til den emitterende gruppen.Så snart den emitterende gruppen er separert fra quenching-gruppen, heves inhiberingen, og den optiske tettheten ved 518nm øker og detekteres av fluorescensdeteksjonssystemet.I renatureringsfasen hybridiserer proben med template-DNAet, og Taq-enzymet i forlengelsesfasen beveger seg langs DNA-templatet med forlengelsen av primeren.Når sonden kuttes av, utløses quenching-effekten og det fluorescerende signalet frigjøres.Hver gang malen kopieres, kuttes en sonde av, ledsaget av frigjøring av et fluorescerende signal.Siden det er et en-til-en forhold mellom antall frigjorte fluoroforer og antall PCR-produkter, kan denne teknikken brukes til å kvantifisere malen nøyaktig.Det eksperimentelle instrumentet bruker vanligvis ABI7100 PCR termisk syklus utviklet av PE-selskapet, og andre termiske syklere kan også brukes.Hvis reaksjonssystemet ABI7700 brukes til eksperimentet, etter at reaksjonen er fullført, kan de kvantitative resultatene gis direkte gjennom datamaskinanalyse.Hvis du bruker andre termiske syklere, må du bruke en fluorescensdetektor for å måle fluorescenssignalet i reaksjonsrøret samtidig for å beregne RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ representerer forholdet mellom luminescensintensiteten til den fluorescerende emisjonsgruppen i prøverøret og luminescensintensiteten til quenching-gruppen, RQ- representerer forholdet mellom de to i det tomme røret, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) representerer mengden av signalendring under fluorescensresultater som kan oppnås etter PCRanti-prosessen.På grunn av introduksjonen av fluorescerende prober, er spesifisiteten til eksperimentet betydelig forbedret.Probedesignet bør generelt oppfylle følgende betingelser: ① Lengden på sonden bør være ca. 20-40 baser for å sikre spesifisiteten til bindingen.② Innholdet av GC-baser er mellom 40 % og 60 % for å unngå duplisering av enkeltnukleotidsekvenser.③ Unngå hybridisering eller overlapping med primere.④ Stabiliteten til bindingen mellom proben og malen er større enn stabiliteten til bindingen mellom primeren og malen, så Tm-verdien til proben bør være minst 5°C høyere enn Tm-verdien til primeren.I tillegg har konsentrasjonen av proben, homologien mellom proben og malsekvensen, og avstanden mellom proben og primeren alle en innvirkning på de eksperimentelle resultatene.
Relaterte produkter:
Kina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman produsent og leverandør |Foregene (foreivd.com)
Innleggstid: 15. oktober 2021
