Forklaring av grunnleggende molekylærbiologiske termer
1. cDNA og cccDNA: cDNA er et dobbelttrådet DNA syntetisert av revers transkriptase fra mRNA;cccDNA er et plasmid dobbelttrådet lukket sirkulært DNA fritt fra kromosomet.
2. Standard foldeenhet: proteinsekundærstrukturenheten α-helix og β-sheet kan danne strukturelle blokker med spesielle geometriske arrangementer gjennom ulike bindende polypeptider.Denne typen bestemt folding kalles vanligvis supersekundær struktur.Nesten alle tertiære strukturer kan beskrives av disse foldetypene, og til og med deres kombinerte typer, så de kalles også standard foldeenheter.
3. CAP: syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) reseptorprotein CRP (cAMP reseptorprotein), komplekset som dannes etter kombinasjonen av cAMP og CRP kalles aktiverende protein CAP (cAMP aktivert protein)
4. Palindromisk sekvens: Den omvendte komplementære sekvensen til et segment av et DNA-fragment, ofte et restriksjonsenzymsete.
5. micRNA: Komplementært interfererende RNA eller antisense-RNA, som er komplementært til mRNA-sekvensen og kan hemme translasjonen av mRNA.
6. Ribozyme: RNA med katalytisk aktivitet, som spiller en autokatalytisk rolle i spleiseprosessen av RNA.
7. Motiv: Det er noen lokale regioner med lignende tredimensjonal form og topologi i den romlige strukturen til proteinmolekyler
8. Signalpeptid: et peptid med 15-36 aminosyrerester ved N-terminalen under proteinsyntese, som styrer transmembranen til proteinet.
9. Attenuator: En nukleotidsekvens mellom en operatorregion og et strukturelt gen som terminerer transkripsjon.
10. Magic Spot: Når bakterien vokser og møter fullstendig mangel på aminosyrer, vil bakteriene produsere en nødrespons for å stoppe ekspresjonen av alle gener.Signalene som genererer denne nødresponsen er guanosin-tetrafosfat (ppGpp) og guanosinpentafosfat (pppGpp).Rollen til PpGpp og pppGpp er ikke bare en eller noen få operoner, men påvirker et stort antall av dem, så de kalles superregulatorer eller magiske flekker.
11. Oppstrøms promoterelement: refererer til DNA-sekvensen som spiller en regulerende rolle i aktiviteten til promoteren, slik som TATA i -10-regionen, TGACA i -35-regionen, forsterkere og attenuatorer.
12. DNA-probe: et merket segment av DNA med en kjent sekvens, som er mye brukt til å oppdage ukjente sekvenser og screene målgener.
13. SD-sekvens: Det er bindingssekvensen til ribosom og mRNA, som regulerer translasjonen.
14. Monoklonalt antistoff: Et antistoff som kun virker mot en enkelt antigen determinant.
15. Kosmid: Det er en kunstig konstruert eksogen DNA-vektor som beholder COS-regionene i begge ender av fagen og er koblet til plasmidet.
16. Blå-hvit flekkscreening: LacZ-genet (koder for β-galaktosidase), enzymet kan bryte ned det kromogene substratet X-gal (5-brom-4-klor-3-indol-β-D-galaktosid) for å produsere blått, og dermed gjøre stammen blå.Når det eksogene DNA-et settes inn, kan ikke LacZ-genet uttrykkes, og stammen er hvit, for å screene de rekombinante bakteriene.Dette kalles blå-hvit screening.
17. Cis-virkende element: En spesifikk sekvens av baser i DNA som regulerer genuttrykk.
18. Klenow-enzym: Stort fragment av DNA-polymerase I, bortsett fra at 5'3'-eksonukleaseaktiviteten fjernes fra DNA-polymerase I-holoenzymet
19. Forankret PCR: brukes til å amplifisere DNA av interesse med en kjent sekvens i den ene enden.En poly-dG-hale ble tilsatt til den ene enden av den ukjente sekvensen, og deretter ble poly-dC og den kjente sekvensen brukt som primere for PCR-amplifisering.
20. Fusjonsprotein: Genet til eukaryotisk protein er forbundet med eksogent gen, og proteinet som består av translasjonen av originalt genprotein og eksogent protein uttrykkes samtidig.
Andre molekylærbiologiske termer
1. Det fysiske kartet over DNA er rekkefølgen de (restriksjonsendonukleasefordøyde) fragmentene av DNA-molekylet er ordnet i.
2. Spaltningen av RNase er delt inn i to typer (autokatalyse) og (heterokatalyse).
3. Det er tre initieringsfaktorer i prokaryoter er (IF-1), (IF-2) og (IF-3).
4. Transmembrane proteiner krever veiledning (signalpeptider), og rollen til proteinchaperoner er (hjelper til å folde peptidkjeden inn i proteinets native konformasjon).
5. Elementer i promotorer kan generelt deles inn i to typer: (kjernepromotorelementer) og (oppstrøms promotorelementer).
6. Molekylærbiologiens forskningsinnhold omfatter i hovedsak tre deler: (strukturell molekylærbiologi), (genuttrykk og regulering), og (DNA-rekombinasjonsteknologi).
7. De to nøkkeleksperimentene som viser at DNA er det genetiske materialet er (pneumokokkinfeksjon hos mus) og (T2 faginfeksjon av Escherichia coli).potensiell).
8. Det er to hovedforskjeller mellom hnRNA og mRNA: (hnRNA spleises i prosessen med å konvertere til mRNA), (5'-enden av mRNA-en er tilsatt en m7pGppp-hette, og det er en ekstra polyadenylering i 3'-enden av mRNA-syren (polyA)-halen).
9. Fordelene med multi-underenhetsformen av protein er (underenhet er en økonomisk metode for DNA-utnyttelse), (kan redusere virkningen av tilfeldige feil i proteinsyntese på proteinaktivitet), (aktivitet kan være svært effektivt og raskt åpnes og lukkes).
10. Hovedinnholdet i proteinfoldingsmekanismen første kjernedannelsesteori inkluderer (kjernedannelse), (strukturell anrikning), (endelig omorganisering).
11. Galaktose har en dobbel effekt på bakterier;på den ene siden (det kan brukes som en karbonkilde for cellevekst);på den annen side (det er også en del av celleveggen).Derfor er en cAMP-CRP-uavhengig promoter S2 nødvendig for permanent syntese på bakgrunnsnivå;samtidig er en cAMP-CRP-avhengig promoter S1 nødvendig for å regulere høynivåsyntesen.Transkripsjon starter fra (S2) med G og fra (S1) uten G.
12. Rekombinant DNA-teknologi er også kjent som (genkloning) eller (molekylær kloning).Det endelige målet er (å overføre den genetiske informasjonen DNA i en organisme til en annen organisme).Et typisk DNA-rekombinasjonseksperiment inkluderer vanligvis følgende trinn: (1) Trekk ut målgenet (eller det eksogene genet) til donororganismen, og koble det enzymatisk til et annet DNA-molekyl (kloningsvektor) for å danne et nytt rekombinant DNA-molekyl.② Det rekombinante DNA-molekylet overføres til mottakercellen og replikeres i mottakercellen.Denne prosessen kalles transformasjon.③ Undersøk og identifiser de mottakercellene som har absorbert det rekombinante DNA.④ Dyrk cellene som inneholder rekombinant DNA i store mengder for å oppdage om fremmedhjelpsgenet kommer til uttrykk.
13. Det finnes to typer plasmidreplikasjon: de som er strengt kontrollert av vertscelleproteinsyntese kalles (tette plasmider), og de som ikke er strengt kontrollert av vertscelleproteinsyntese kalles (avslappede plasmider).
14. PCR-reaksjonssystemet bør ha følgende betingelser: a.DNA-primere (ca. 20 baser) med komplementære sekvenser i hver ende av de to strengene til målgenet som skal separeres.b.Enzymer med termisk stabilitet som: TagDNA polymerase.c, dNTPd, DNA-sekvens av interesse som mal
15. Den grunnleggende reaksjonsprosessen til PCR inkluderer tre stadier: (denaturering), (annealing) og (forlengelse).
16. Den grunnleggende prosessen for transgene dyr inkluderer vanligvis: ①Introduksjon av klonet fremmed gen i kjernen til et befruktet egg eller embryonal stamcelle;②Transplantasjon av det inokulerte befruktede egget eller den embryonale stamcellen til den kvinnelige livmoren;③Fullstendig embryonal utvikling og vekst For avkommet med fremmede gener;④ Bruk disse dyrene som kan produsere fremmede proteiner som avlsdyr for å avle nye homozygote linjer.
17. Hybridomcellelinjer genereres ved å hybridisere (milt B) celler med (myelom)celler, og siden (miltceller) kan utnytte hypoxantin og (beinceller) gi celledelingsfunksjoner, kan de dyrkes i HAT-medium.vokse.
18. Med utdypingen av forskningen kalles første generasjon antistoffer (polyklonale antistoffer), andre generasjon (monoklonale antistoffer) og tredje generasjon (genteknologiske antistoffer).
19. For tiden er genteknologien av insektvirus hovedsakelig fokusert på baculovirus, som manifesteres i introduksjonen av (eksogent toksin-gen);(gener som forstyrrer den normale livssyklusen til insekter);(modifikasjon av virusgener).
20. De transvirkende proteinfaktorene som tilsvarer de vanlige elementene TATA, GC og CAAT i pattedyr-RNA-polymerase II-promotoren er henholdsvis (TFIID), (SP-1) og (CTF/NF1).
tjueen.De grunnleggende transkripsjonsfaktorene til RNA-polymerase Ⅱ er TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, og deres bindingssekvens er: (D, A, B, E).Der funksjonen til TFII-D er (binding til TATA-boks).
tjueto.De fleste av transkripsjonsfaktorene som binder seg til DNA virker i form av dimerer.De funksjonelle domenene til transkripsjonsfaktorer som binder seg til DNA er vanligvis følgende (helix-turn-helix), (sinkfingermotiv), (basic-leucin) glidelåsmotiv).
tjue-tre.Det er tre typer restriksjonsendonuklease-spaltningsmoduser: (kuttet på 5'-siden av symmetriaksen for å generere 5'-klebende ender), (kutt på 3'-siden av symmetriaksen for å generere 3'-klebrige ender (kutt på symmetriaksen for å generere flate segmenter) ).
tjuefire.Plasmid-DNA har tre forskjellige konfigurasjoner: (SC-konfigurasjon), (oc-konfigurasjon), (L-konfigurasjon).Den første i elektroforese er (SC-konfigurasjon).
25. Eksogene genekspresjonssystemer, hovedsakelig (Escherichia coli), (gjær), (insekt) og (pattedyrcelletabell).
26. De vanligste metodene for transgene dyr er: (retroviral infeksjonsmetode), (DNA mikroinjeksjonsmetode), (embryonal stamcellemetode).
Applikasjon Molekylærbiologi
1. Nevn funksjonene til mer enn 5 RNA?
Overfør RNA tRNA Overføringsaminosyre Ribosom RNA rRNA Ribosom utgjør messenger RNA mRNA Proteinsyntesemal Heterogen kjernefysisk RNA hnRNA Forløper for modent mRNA lite kjernefysisk RNA snRNA Involvert i hnRNA-spleising Små RNA-spleising Små RNA scRNA/7SL-RNA cytoplasmatiske RNA scRNA/7SL-RNAs cytoplasmatiske RNA-sRNA/7SL-RNA-relaterte RNA-signaler, rekulert RNA og RNA syntet RNA-retikulert RNA-komponenter i plasma. /micRNA Regulerer genuttrykk Ribozyme RNA Enzymatisk aktivt RNA
2. Hva er hovedforskjellen mellom prokaryote og eukaryote promotorer?
Prokaryot TTGACA --- TATAAT------Initieringssted-35 -10 Eukaryotisk Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Initieringssted-110 -70 -25
3. Hva er hovedaspektene ved kunstig konstruksjon av naturlige plasmider?
Naturlige plasmider har ofte defekter, så de er ikke egnet for bruk som bærere for genteknologi, og må modifiseres og konstrueres: a.Legg til passende seleksjonsmarkørgener, slik som to eller flere, som er enkle å bruke for seleksjon, vanligvis antibiotikagener.b.Øk eller reduser egnede enzymskjæringssteder for å lette rekombinasjon.c.Forkort lengden, kutt av unødvendige fragmenter, forbedre importeffektiviteten og øke lastekapasiteten.d.Endre replikonen, fra stram til løs, fra færre kopier til flere kopier.e.Legg til spesielle genetiske elementer i henhold til de spesielle kravene til genteknologi
4. Gi et eksempel på en metode for differensiell screening av vevsspesifikt cDNA?
To cellepopulasjoner fremstilles, målgenet er uttrykt eller sterkt uttrykt i en av cellene, og målgenet er ikke uttrykt eller lavt uttrykt i den andre cellen, og deretter blir målgenet funnet ved hybridisering og sammenligning.For eksempel, under forekomsten og utviklingen av svulster, vil tumorceller presentere mRNA med andre ekspresjonsnivåer enn normale celler.Derfor kan tumorrelaterte gener screenes ut ved differensiell hybridisering.Induksjonsmetoden kan også brukes til å sile ut genene hvis ekspresjon induseres.
5. Generering og screening av hybridomcellelinjer?
Milt B-celler + myelomceller, tilsett polyetylenglykol (PEG) for å fremme cellefusjon, og miltens B-myelomfusjonsceller dyrket i HAT-medium (inneholder hypoxanthin, aminopterin, T) fortsetter å ekspandere og nære.Cellefusjonen inneholder: milt-milt fusjonsceller: ikke i stand til å vokse, miltceller kan ikke dyrkes in vitro.Ben-beinfusjonsceller: kan ikke bruke hypoxanthin, men kan syntetisere purin gjennom den andre veien ved å bruke folatreduktase.Aminopterin hemmer folatreduktase og kan dermed ikke vokse.Ben-milt fusjonsceller: kan vokse i HAT, miltceller kan bruke hypoxanthin, og beinceller gir celledelingsfunksjon.
6. Hva er prinsippet og metoden for å bestemme primærstrukturen til DNA ved hjelp av dideoksy-terminaltermineringsmetoden (Sanger-metoden)?
Prinsippet er å bruke en nukleotidkjedeterminator-2,,3,-dideoksynukleotid for å terminere forlengelsen av DNA.Siden den mangler 3-OH som kreves for dannelse av 3/5/fosfodiesterbindinger, når den først er inkorporert i DNA-kjeden, kan ikke DNA-kjeden utvides ytterligere.I henhold til prinsippet om baseparing, når DNA-polymerase trenger dNMP for å delta i den normalt utvidede DNA-kjeden, er det to muligheter, den ene er å delta i ddNTP, som resulterer i terminering av deoksynukleotidkjedeforlengelsen;den andre er å delta i dNTP, slik at DNA-kjeden fortsatt kan forlenges til neste ddNTP er inkorporert.I henhold til denne metoden kan en gruppe DNA-fragmenter av forskjellig lengde som ender på ddNTP oppnås.Metoden er å dele inn i fire grupper henholdsvis ddAMP, ddGMP, ddCMP og ddTMP.Etter reaksjonen kan polyakrylamidgelelektroforese lese DNA-sekvensen i henhold til svømmebåndene.
7. Hva er den positive reguleringseffekten av aktivatorprotein (CAP) på transkripsjon?
Syklisk adenylat (cAMP) reseptorprotein CRP (cAMP reseptorprotein), komplekset dannet av kombinasjonen av cAMP og CRP kalles CAP (cAMPaktivert protein).Når E. coli dyrkes i et medium som mangler glukose, øker syntesen av CAP, og CAP har som funksjon å aktivere promotorer som laktose (Lac).Noen CRP-avhengige promotere mangler den typiske -35 region sekvensfunksjonen (TTGACA) som vanlige promotere har.Derfor er det vanskelig for RNA-polymerase å binde seg til den.Tilstedeværelsen av CAP (funksjon): kan forbedre bindingskonstanten til enzym og promoter betydelig.Den viser hovedsakelig følgende to aspekter: ① CAP hjelper enzymmolekylet til å orientere seg riktig ved å endre konformasjonen til promoteren og interaksjonen med enzymet, for å kombinere med -10-regionen og spille rollen som å erstatte funksjonen til -35-regionen.②CAP kan også hemme bindingen av RNA-polymerase til andre steder i DNA, og dermed øke sannsynligheten for binding til dens spesifikke promoter.
8. Hvilke trinn er vanligvis inkludert i et typisk DNA-rekombinasjonseksperiment?
en.Trekk ut målgenet (eller det eksogene genet) til donororganismen, og koble det enzymatisk til et annet DNA-molekyl (kloningsvektor) for å danne et nytt rekombinant DNA-molekyl.b.Overfør det rekombinante DNA-molekylet til mottakercellen og repliker og bevar det i mottakercellen.Denne prosessen kalles transformasjon.c.Screen og identifiser de mottakercellene som har absorbert det rekombinante DNA.d.Massekultur cellene som inneholder det rekombinante DNA for å oppdage om fremmedhjelpsgenet uttrykkes.
9. Konstruksjon av genbibliotek Tre metoder for screening av rekombinanter er gitt og prosessen er kort beskrevet.
Antibiotikaresistensscreening, insersjonsinaktivering av resistens, blå-hvit flekkscreening eller PCR-screening, differensialscreening, DNA-probe De fleste kloningsvektorer bærer antibiotikaresistensgener (anti-ampicillin, tetracyklin).Når plasmidet overføres til Escherichia coli, vil bakteriene oppnå resistens, og de uten overføring vil ikke ha resistens.Men den kan ikke skille om den er omorganisert eller ikke.I en vektor som inneholder to resistensgener, hvis et fremmed DNA-fragment settes inn i et av genene og fører til at genet inaktiveres, kan to platekontroller som inneholder forskjellige medikamenter brukes til å screene for positive rekombinanter.For eksempel inneholder pUC-plasmidet LacZ-genet (som koder for β-galaktosidase), som kan dekomponere det kromogene substratet X-gal (5-brom-4-klor-3-indol-β-D-galaktosid) for å produsere blått, og dermed gjøre stammen blå.Når det fremmede DNA settes inn, kan ikke LacZ-genet uttrykkes, og stammen er hvit, for å screene de rekombinante bakteriene.
10. Forklar den grunnleggende prosessen med å skaffe transgene dyr gjennom embryonale stamceller?
Embryonale stamceller (ES) er embryonale celler under embryonal utvikling, som kan dyrkes kunstig og formere seg og har som funksjon å differensiere til andre typer celler.Kultur av ES-celler: Blastocystens indre cellemasse isoleres og dyrkes.Når ES dyrkes i et materfritt lag, vil det differensiere til ulike funksjonelle celler som muskelceller og N-celler.Når det dyrkes i et medium som inneholder fibroblaster, vil ES opprettholde differensieringsfunksjonen.ES kan manipuleres genetisk, og differensieringsfunksjonen kan integreres uten å påvirke differensieringsfunksjonen, noe som løser problemet med tilfeldig integrasjon.Introduser eksogene gener i embryonale stamceller, implanter deretter i livmoren til gravide hunnmus, utvikler seg til unger og kryss for å oppnå homozygote mus.
