Ingen forsterkningssignaler

1. Taq DNA-polymerase i settet mister sin aktivitet på grunn av feil oppbevaring eller utløp av settet.
Anbefaling: Bekreft oppbevaringsforholdene for settet;legg til en passende mengde Taq DNA-polymerase på nytt i PCR-systemet eller kjøp et nytt Real Time PCR-sett for relaterte eksperimenter.

2. Det er mange hemmere av Taq DNA-polymerase i DNA-malen.
Forslag: Rens malen på nytt eller reduser mengden mal som brukes.

3. Mg2+-konsentrasjonen er ikke egnet.
Anbefaling: Mg2+ konsentrasjonen av 2× Real PCR Mix vi tilbyr er 3,5 mM.For noen spesielle primere og maler kan imidlertid Mg2+-konsentrasjonen være høyere.Derfor kan du tilsette MgCl2 direkte for å optimalisere Mg2+-konsentrasjonen.Det anbefales å øke Mg2+ 0,5 mM hver gang for optimalisering.

4. PCR-amplifikasjonsbetingelsene er ikke egnet, og primersekvensen eller konsentrasjonen er feil.
Forslag: bekreft riktigheten av primersekvensen og primeren har ikke blitt degradert;Hvis forsterkningssignalet ikke er bra, prøv å senke annealingstemperaturen og juster primerkonsentrasjonen på riktig måte.

5. Mengden mal er for liten eller for mye.
Anbefaling: Utfør mallineariseringsgradientfortynning, og velg malkonsentrasjonen med den beste PCR-effekten for sanntids PCR-eksperiment.

NTC har for høy fluorescensverdi

1.Reagenskontaminering forårsaket under drift.
Anbefaling: Bytt ut med nye reagenser for sanntids PCR-eksperimenter.

2. Forurensning skjedde under fremstillingen av PCR-reaksjonssystemet.
Anbefaling: Ta nødvendige beskyttelsestiltak under drift, som: bruk av latekshansker, bruk av pipettespiss med filter, etc.

3. Primerne brytes ned, og nedbrytningen av primerne vil forårsake uspesifikk amplifikasjon.
Forslag: Bruk SDS-PAGE-elektroforese for å oppdage om primerne er degradert, og erstatt dem med nye primere for sanntids PCR-eksperimenter.

Primer dimer eller ikke-spesifikk amplifikasjon

1. Mg2+-konsentrasjonen er ikke egnet.
Anbefaling: Mg2+ konsentrasjonen til 2× Real PCR EasyTM Mix vi tilbyr er 3,5 mM.For noen spesielle primere og maler kan imidlertid Mg2+-konsentrasjonen være høyere.Derfor kan du tilsette MgCl2 direkte for å optimalisere Mg2+-konsentrasjonen.Det anbefales å øke Mg2+ 0,5 mM hver gang for optimalisering.

2. PCR-glødetemperaturen er for lav.
Forslag: Øk PCR-glødingstemperaturen med 1 ℃ eller 2 ℃ hver gang.

3.PCR-produktet er for langt.
Anbefaling: Lengden på sanntids PCR-produktet bør være mellom 100-150 bp, ikke mer enn 500 bp.

4. Primerne brytes ned, og nedbrytningen av primerne vil føre til utseendet til spesifikk amplifikasjon.
Forslag: Bruk SDS-PAGE-elektroforese for å oppdage om primerne er degradert, og erstatt dem med nye primere for sanntids PCR-eksperimenter.

5. PCR-systemet er feil, eller systemet er for lite.
Forslag: PCR-reaksjonssystemet er for lite vil føre til at deteksjonsnøyaktigheten reduseres.Det er best å bruke reaksjonssystemet anbefalt av det kvantitative PCR-instrumentet for å kjøre Real Time PCR-eksperimentet på nytt.

Dårlig repeterbarhet av kvantitative verdier

1. Instrumentet fungerer ikke.
Forslag: Det kan være feil mellom hvert PCR-hull i instrumentet, noe som resulterer i dårlig reproduserbarhet under temperaturstyring eller deteksjon.Vennligst sjekk i henhold til instruksjonene til det tilsvarende instrumentet.

2. Prøvens renhet er ikke god.
Anbefaling: Urene prøver vil føre til dårlig reproduserbarhet av eksperimentet, som inkluderer renheten til malen og primere.Det er best å rense malen på nytt, og primerne renses best med SDS-PAGE.

3. Forberedelses- og lagringstiden for PCR-systemet er for lang.
Forslag: Bruk Real Time PCR-systemet for PCR-eksperiment umiddelbart etter klargjøring, og ikke la det stå til side for lenge.

4. PCR-amplifikasjonsbetingelsene er ikke egnet, og primersekvensen eller konsentrasjonen er feil.
Forslag: bekreft riktigheten av primersekvensen og primeren har ikke blitt degradert;Hvis forsterkningssignalet ikke er bra, prøv å senke annealingstemperaturen og juster primerkonsentrasjonen på riktig måte.

5. PCR-systemet er feil, eller systemet er for lite.
Forslag: PCR-reaksjonssystemet er for lite vil føre til at deteksjonsnøyaktigheten reduseres.Det er best å bruke reaksjonssystemet anbefalt av det kvantitative PCR-instrumentet for å kjøre Real Time PCR-eksperimentet på nytt.