Escherichia Coli O157: H7 nukleinsyredeteksjonssett (PCR-fluorescerende probemetode/lyofilisering)
Kitbeskrivelse:
Kat.nr.FP103
Den brukes til rask påvisning og screening av E. coli O157:H7 i mat-, fôr-, vannprøver og miljøprøver.
Beskrivelser
Den brukes tilrask påvisning og screening av E. coli O157:H7 i mat, fôr, vannprøver og miljøprøver.
[Testprinsipp]
I henhold til prinsippet om fluorescerende PCR-teknologi er spesifikke primere og Taqman-prober designet for det spesifikke genet til Escherichia coli O157: H7, og detektert av et fluorescerende PCR-instrument, for å realisere påvisningen av Escherichia coli O157: H7 Kvalitativ påvisning av DNA.
Settets innhold
Merk: ROX-kanalsonde er ikke inkludert.
| Componenter | Spesifikasjon | Qmengde |
| Buffer A | Rør | 1 |
| Buffer B | Rør | 1 |
| Positiv kontroll | Rør | 1 |
| Negativ kontroll | Rør | 1 |
Forventet bruk
Den brukes til rask påvisning og screening av E. coli O157:H7 i mat, fôr, vannprøver og miljøprøver.
Lagringsbetingelser og utløpsdato
Oppbevares ved -20 ℃ i mørket og unngå gjentatt frysing og tining.
Gyldighetsperioden er 12måneder, og produksjonsdatoen er vist på ytteremballasjen.
Instrumenter og forbruksvarer
Fluorescerende kvantitativt PCR-instrument, pipettepistol og matchende spisser, vortex shaker, minisentrifuge.
Bruk
1. Prøvebehandling
1.1 Prøvetype: Dette settet er egnet for mat-, fôr-, vannprøver og andre prøver som mistenkes å være forurenset av Escherichia coli O157:H7.For dypt bearbeidede kjøttprodukter, drikkevarer og andre stoffer som inneholder pigmenter, må de skylles for å unngå å påvirke fluorescenssignalsamlingen.
1.2 Prøvebehandling: Se "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" for prøvepreparering, anrikningskultur og isolering av Escherichia coli O157: H7.
- Nukleinsyreekstraksjon
Ta 20 mL anrikningsløsning i et 1,5 mL sentrifugerør, tilsett 200 μL mikrobielt lysat (ekstra sett er nødvendig), vortex i 30 sekunder, sentrifuger kort og sett til side.
Merknader: Ekstraksjonen av nukleinsyre fra lysatet bør fullføres innen 10 minutter, og kan ikke lagres over lengre tid.
3. Nukleinsyreamplifikasjon
3.1 Slå på det fluorescerende kvantitative PCR-instrumentet for bruk.
Buffer A og Buffer B fra settet, smelt dem grundig og sentrifuger kort.Tilsett 18 μL buffer A og 2 μL buffer B til hvert PCR-reaksjonsrør.Tilsett deretter 5 mL hver av den negative kontrollen, den ekstraherte nukleinsyren og den positive kontrollen i PCR-reaksjonsrørene, lokk på rørene og sentrifuger kort.
3.3 Overfør PCR-reaksjonsrøret til en fluorescerende PCR-maskin, og bruk følgende prosedyrer for å utføre amplifikasjonseksperimenter: velg 25 ml for reaksjonssystemet, samle fluorescenssignaler ved 60 °C for hver syklus, og velg FAM for deteksjonskanalen.
| Steg | Program | Antall sykluser |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (samle fluorescens) |
Veiledninger for problemanalyse
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Ingen RNA kan ekstraheres eller utbyttet av nukleinsyre er lavt
Det er vanligvis mange faktorer som påvirker utvinningseffektiviteten, for eksempel: prøve-RNA-innhold, operasjonsmetode, elueringsvolum, etc.。
Analyse av vanlige årsaker:
1. Isbad eller lavtemperatur (4 ° C) sentrifugering under drift.
Forslag: Romtemperatur (15-25 ° C) drift, aldri isbad og lavtemperatur sentrifuge.
2. Feil prøveoppbevaring eller prøveoppbevaring for lenge.
Forslag: Oppbevar prøver ved -80 ° C eller frys i flytende nitrogen, og unngå gjentatt bruk av fryse-tine;prøv å bruke ferske innsamlede prøver for RNA-ekstraksjon.
3.Utilstrekkelig prøvelysis
Anbefaling: Sørg for at prøven og arbeidsløsningen (lineært akrylamid) har blitt grundig blandet og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur (15-25 ° C)
4. Eluenten ble tilsatt feil
Anbefaling: Sørg for at RNase-Free ddH2O tilsettes til midten av membranen til rensekolonnen
5. Feil volum av vannfri etanol i buffer viRW2
Forslag: Følg instruksjonene, tilsett riktig volum vannfri etanol til Buffer viRW2 og bland dem godt før du bruker settet.
6. Feil prøvebruk.
Forslag: 200 µl prøve per 500 µl buffer viRL.For stort prøvevolum vil resultere i redusert RNA-ekstraksjonshastighet.
7. Feil elueringsvolum eller ufullstendig eluering.
Forslag: Elueringsvolumet i rensekolonnen er 30-50μl;hvis elueringseffekten ikke er tilfredsstillende, anbefales det å tilsette forvarmet RNase-fri ddH2O og forleng tiden ved plassering ved romtemperatur, for eksempel 5-10 min
8.Rensingskolonnen har etanolrester etter skylling i Buffer viRW2.
Forslag: Hvis etanol fortsatt er igjen etter skylling i Buffer viRW2 og sentrifugering med tomme rør i 2 minutter, kan rensekolonnen stå i romtemperatur i 5 minutter etter sentrifugering med tomme rør for å fjerne gjenværende etanol fullstendig.
Nedbrytningen av rensede RNA-molekyler
Kvaliteten på det rensede RNA er relatert til faktorer som prøvelagring, RNase-kontaminering og drift.
Analyse av vanlige årsaker:
1.De innsamlede prøvene ble ikke lagret i tide.
Forslag: Hvis prøven ikke brukes i tide etter innsamling, vennligst oppbevar den ved -80 ℃ eller flytende nitrogen umiddelbart.For utvinning av RNA-molekyler, prøv å bruke ferske innsamlede prøver når det er mulig.
2. Innsamlede prøver ble fryst og tint gjentatte ganger.
Forslag: Unngå gjentatt frysing og tining (ikke mer enn én gang) under prøvetaking og lagring, ellers vil utbyttet av nukleinsyre reduseres.
3.RNase ble introdusert i operasjonssalen eller ingen engangshansker, masker osv. ble brukt.
Forslag: Eksperimentet med ekstraksjon av RNA-molekyler utføres best i et eget RNA-operasjonsrom, og forsøksbordet rengjøres før forsøket.Bruk engangshansker og -masker under eksperimentet for å unngå RNA-nedbrytning forårsaket av RNase-introduksjon.
4.Reagensen er kontaminert av RNase under bruk.
Forslag: Bytt ut med nytt viralt RNA-isolasjonssett for relaterte eksperimenter.
5. RNase-kontamineringen av sentrifugerørene, pipettespissene osv. Forslag: Sørg for at sentrifugerørene, pipettespissene og pipettene alle er RNase-frie.
De rensede RNA-molekylene påvirket nedstrøms eksperimenter
RNA-molekylene renset av rensekolonnen vil påvirke nedstrøms eksperimenter hvis det er for mye saltioner eller proteiner, for eksempel: omvendt transkripsjon, Northern Blot, etc..
1. Det er gjenværende salioner i de eluerte RNA-molekylene.
Anbefaling: Sørg for at riktig volum vannfri etanol er tilsatt Buffer viRW2, og vask rensekolonnen to ganger i henhold til riktig sentrifugeringshastighet i bruksanvisningen. Hvis det fortsatt er saltioner igjen, kan du tilsette Buffer viRW2 til rensekolonnen, og la den stå i romtemperatur i 5 minutter.Utfør deretter sentrifugering for å fjerne forurensning av saltioner i størst grad
2. Det er gjenværende etanol i de eluerte RNA-molekylene
Forslag: Når du har bekreftet at rensekolonnene har blitt skylt med Buffer viRW2, utfør sentrifugering med tomme rør i henhold til sentrifugalhastigheten i bruksanvisningen.Hvis det fortsatt er etanol igjen, kan det stå i 5 minutter i romtemperatur etter sentrifugering med tomme rør for å fjerne gjenværende etanol i størst grad.
Bruksanvisninger:
Bruksanvisning for viralt RNA-isolasjonssett
