Vi har vært erfaren produsent.Å vinne flertallet i de avgjørende sertifiseringene av markedet for store rabatter i Kina med høy følsomhet ett-trinns sonde Rt-QpcrKit V2, Kvalitet er fabrikkens liv, Fokus på kundenes etterspørsel er kilden til selskapets overlevelse og utvikling, Vi holder oss til ærlighet og god tro arbeidsholdning, ser frem til at du kommer!
Vi har vært erfaren produsent.Vinne flertallet i de avgjørende sertifiseringer av sitt marked forKina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Vårt firma lover: rimelige priser, kort produksjonstid og tilfredsstillende ettersalgsservice, vi ønsker deg også velkommen til å besøke fabrikken vår når som helst du vil.Skulle ønske vi nå har en hyggelig og langsiktig virksomhet sammen!!!

Beskrivelser

Dette settet bruker et unikt lyseringsbuffersystem som raskt kan frigjøre RNA fra dyrkede celleprøver for RT-qPCR-reaksjoner, og dermed eliminere den tidkrevende og arbeidskrevende RNA-renseprosessen.RNA-malen kan fås på bare 7 minutter.Reagensene 5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR levert av settet kan raskt og effektivt oppnå kvantitative PCR-resultater i sanntid.

5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR har sterk inhibitortoleranse, og lysatet til prøvene kan brukes som mal for RT-qPCR direkte.Dette settet inneholder den unike RNA høyaffinitet Foregene revers transkriptase, og Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaksjonsbuffer, PCR-optimalisering og stabilisator.

Spesifikasjoner

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Komponenter i sett

Egenskaper og fordeler

■ Enkelt og effektivt: med Cell Direct RT-teknologi kan RNA-prøver tas på bare 7 minutter.

■ Prøvebehovet er lite, så lite som 10 celler kan testes.

■ Høy gjennomstrømning: den kan raskt oppdage RNA i celler dyrket i 384, 96, 24, 12, 6-brønns plater.

■ DNA Eraser kan raskt fjerne frigjorte genomer, redusere effekten på etterfølgende eksperimentelle resultater.

■ Optimalisert RT- og qPCR-system gjør to-trinns RT-PCR revers transkripsjon mer effektiv og PCR mer spesifikk og mer motstandsdyktig mot RT-qPCR-reaksjonshemmere.

Påføring av sett

Anvendelsesområde: dyrkede celler.

- RNA frigitt ved prøvelysis: gjelder kun for RT-qPCR-malen til dette settet.

- Settet kan brukes til følgende formål: genekspresjonsanalyse, verifisering av siRNA-mediert gendempende effekt, medikamentscreening, etc.

Diagram

Lagring og holdbarhet

Del I av dette settet bør oppbevares ved 4 ℃;Del II bør lagres ved -20 ℃.

Foregene Protease Plus II bør oppbevares ved 4 ℃, ikke frys ved -20 ℃.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR skal oppbevares ved -20 ℃ i mørket;hvis den brukes ofte, kan den også lagres ved 4 ℃ for korttidslagring (bruk opp innen 10 dager). Vi har vært erfarne produsenter.Vinner flertallet i de avgjørende sertifiseringene i markedet for store rabatter i Kina med høy følsomhet ett-trinns probe Rt-Qpcr Kit V2, kvalitet er fabrikkens liv, fokus på kundenes etterspørsel er kilden til selskapets overlevelse og utvikling, vi holder oss til ærlighet og god tro arbeidsholdning, ser frem til at du kommer!
Stor rabattKina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Vårt firma lover: rimelige priser, kort produksjonstid og tilfredsstillende ettersalgsservice, vi ønsker deg også velkommen til å besøke fabrikken vår når som helst du vil.Skulle ønske vi nå har en hyggelig og langsiktig virksomhet sammen!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.nr.DRT-01021/01022

For celledirekte RT-qPCR ved bruk av ≤ 1000 000 celler

Produkt introduksjon

Dette produktet bruker et unikt lyseringsbuffersystem for raskt å frigjøre RNA fra dyrkede celleprøver for RT-qPCR-reaksjoner, eliminere den tidkrevende og arbeidskrevende RNA-renseprosessen, og bare 7 minutter for å oppnå den nødvendige RNA-malen, med 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman levert av settet kan raskt og effektivt oppnå PCR-resultater i sanntid.

5× Direct RT Mix og 2× Direct qPCR Mix-Taqman har sterk inhibitortoleranse og kan utføre effektiv reversering og spesifikk amplifikasjon ved å bruke lysatet til prøven som skal måles som en mal.Reagenset inneholder Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer og Stabilizer, som kan brukes med lyseringsbuffer for raskt og enkelt å oppdage prøver, og har egenskapene høy sensitivitet, spesifisitet og stabilitet.

Produktfunksjoner

Enkel, effektiv Cell Direct RT-teknologi som tar så lite som 7 minutter å få RNA-prøver.

Prøvekravene er små, og minimum 10 dyrkede celler kan brukes til eksperimentering.

Høy gjennomstrømning for rask RNA-innsamling av dyrkede celler som 384, 96, 24, 12 og 6-brønns plater.

DNA Eraser er i stand til raskt å fjerne frigjorte genomer, noe som i stor grad reduserer innvirkningen på påfølgende eksperimentelle resultater.

Optimaliserte RT- og qPCR-systemer muliggjør totrinns RT-PCR med mer effektiv revers transkripsjon, spesifisitet og sterkere RT-qPCR-reaksjonsinhibitortoleranse.

Påføring av sett

Anvendelsesområde: Dyrkede celler.

Prøvelyse tolket RNA: brukes bare som en totrinns RT-qPCR-mal.

Sett kan brukes til følgende formål: analyse av genregulerende uttrykk, alleltesting, medikamentscreening, etc.

Settbegrensninger

Amplifiserte fragmenter ≤ 300 bp.

Sett brukes til å nydyrke celler.

Produktkvalitetskontroll

I henhold til FOREGENEs Total Quality Management System, blir hver batch av settene i Cell Direct RT-qPCR-serien grundig testet flere ganger for å sikre påliteligheten og stabiliteten til kvaliteten til hver batch med sett.

Settets innhold

*:Cellelysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kan kjøpes separat, detaljer er gitt i vedlegg 1 (SIDE 13).

Lagringsforhold

1. Fraktbetingelser

Hele prosessen med lavtemperatur isposetransport, for å sikre at settet er i tilstanden <4 °C.

2. Lagringsforhold

Oppbevar del I ved 4°C og del II ved -20°C.

Foregene Protease Plus II bør oppbevares ved 4°C, ikke fryses ved -20°C.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman oppbevares ved -20°C, eller ved 4°C for kortvarig bruk hvis den brukes ofte (innen 10 dager).

Informasjon om settkomponenter

Buffer CL: Gir miljøet som kreves for cellelysereaksjoner.

Buffer ST: Avslutter det aktive stoffet i lysatet for å unngå effekter på etterfølgende RT.

DNA Eraser: DNA-fjerner, effekten av å fjerne genomet på etterfølgende eksperimenter.

5× Direct RT Mix: Inneholder høy RNA-affinitet Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilisatorer, enhancers, optimizers og revers transkripsjonsprimere for optimal justering (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: I sammenheng med lyseringsbuffer lyseres celler for å frigjøre nukleinsyrer.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Denne reagensen inneholder Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaksjonsbuffer, PCR-optimalisering og stabilisator.

20× ROX Reference Dye: Vanligvis brukt på sanntids PCR-amplifikasjonsinstrumenter fra ABI, Stratagene og andre selskaper, den brukes til å justere forskjellen mellom PCR-rør og -rør forårsaket av PCR-doseringsfeil.20× ROX Reference Dye-konsentrasjonen som kreves for forskjellige instrumenter er forskjellig, og brukeren kan legge den til i henhold til den anbefalte konsentrasjonen av instrumentet.

RNase-fri ddH₂O: RNase-fritt sterilisert ultrarent vann for to-trinns RT-qPCR-reaksjoner.

Forholdsregler:(Sørg for å lese forholdsreglene nøye før du bruker settet)

Vær oppmerksom på operasjonsmetoden til eksperimentet for å unngå krysskontaminering mellom prøvene.

Vær oppmerksom på renheten til det eksperimentelle miljøet og redskapene for å unngå RNase-forurensning og RNA-nedbrytning.

Ta ferske eller godt bevarte celleprøver og bruk aldri gjentatte fryse-tinte celleprøver.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman bør unngå gjentatt frysing-tining, ellers vil det påvirke revers transkripsjon og PCR-effektivitet.

Preparasjonerføroperasjon

Sørg for å lese instruksjonene nøye før du bruker dette settet.Cell Direct RT-qPCR-settet er enkelt, praktisk og raskt å betjene, og instruksjonene gir fullstendig informasjon om hele settet og hvordan du bruker det riktig.Vennligst klargjør nødvendige eksperimentelle materialer og utstyr før bruk.

Eksperimentelt materiale og utstyr

◆ Kulturceller.

◆ 1,5 ml eller 2 ml, RNase-/DNase-fritt sentrifugerør, RNase-/DNase-fri spiss, 0,2 ml sterilt qPCR-rør.

◆ qPCR-maskin, pipette, bordsentrifuge (≥13.400×g) (avhengig av forsøksbehov) etc.

Sikkerhet

◆ Dette produktet er kun for vitenskapelige forskningsformål, vennligst ikke bruk det til farmasøytiske, kliniske, mat- og kosmetiske formål.

◆ Når du bruker kjemikalier, bruk passende laboratorieklær, hansker, vernebriller osv.

Operasjonguider

Cellelysesystemer, RT-systemer og qPCR-reaksjonsoppløsningstilskuddspakker kan kjøpes separat, for detaljer i vedlegg 1 (SIDE 13).

Driftsveiledning

A: Prøve RNA-frigjøring

1. Celler ble forbehandlet: Vask cellekulturplaten med kald PBS, lyser deretter cellene (10-10⁶), 10⁶ enn mengden av celler, anbefales Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) eller Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) for RNA-ekstraksjon og rensing.

1.1.Adherente celler (24-brønns plate som et eksempel)

1.1.1.Bestem antall celler i hver brønn, bestem at antall celler er 1 × 10⁵, og bruk en pipette for å fjerne kulturmediet fra kulturskålen.

1.1.2.Tilsett 200 μl forhåndskjølt 1 × PBS til hver brønn.Ikke pipetter gjentatte ganger og fjern PBS fra brønnene.Vipp platen og fjern så mye PBS som mulig.Fortsett til trinn 2.

1.1.3.En annen cellekulturskål eller et referansenummer tabell 1-1 i en cellekulturskål ble tilsatt forhåndskjølt 1 × PBS for cellevask.

Tabell 1-1: PBS-dosering for forskjellig antall celler

Merk:For å sikre en fast adherent celler,et stort antall celletap unngås ved vask.

1.2.Suspensjonsceller eller adherente celler dyrket i ikke-porøse plater

1.2.1.Adherente celler dyrket i ikke-multibrønnplater (suspensjonsceller starter fra neste trinn 1.2.2), samle og separer cellene i henhold til den normale celleinnsamlingsmetoden, og plasser dem i en kulturplate eller sentrifugerør;hvis trypsinisering brukes, kreve sentrifugering for å samle cellene og fjerne gjenværende trypsin, tilsatt PBS resuspenderte celler i individuelle celler for å spre cellene.

1.2.2.Etter antall talte celler ble cellene alikvotert 1×10⁵ en for å sentrifugere rør, samle celler ved sentrifugering ved 1000 × g i 10 min.

1.2.3.Tilsett 200 μl PBS til sentrifugerøret, ikke pipetter gjentatte ganger, og aspirer PBS direkte.fortsett til trinn 2. (Hvis det er vanskelig å utfelle og cellene ble resuspendert igjen, kan utføres 1000×g sentrifugert 10 minutter etter å ha kastet supernatanten, fortsetter cellepelleten til trinn 2)

2. Cellelyse: Fjern buffer CL, dens temperatur ekvilibrert til romtemperatur, DNA Eraser og Foregene Protease Plus II, i henhold til følgende tabell 1-2 forberedt lyseringssystem: (Lyseløsningen er klar til bruk).

Tabell 1-2: spalting systemforberedelse (Merk: i forberedelsen på is)

3.( 24-brønns plate som et eksempel) Pipetter 200 μl cellelyseringsmasterblanding i hver brønn, blås gjentatte ganger 5-10 ganger, inkuber ved romtemperatur (20-25 ℃) i 5 min.

Merk:For å unngå dannelse av bobler, vennligst når pipetteringspipetteskalaen ble justert til 200 μl eller mindre.Cellene kan virke uklare etter lysis, noe som er normalt.

4.(24-brønns plate som et eksempel) tilsettes i væsken 20 μl Buffer ST (forskjellige lyseringssystemer Buffer ST tilsatt i en mengde vist i Tabell 1-3), gjentatt pipettering 5-10 ganger, ved romtemperatur (20-25 ℃) ble inkubert i 2 min.

Merk:Pipettespissen ble plassert under overflaten, og sørget for at lysatet ble tilsatt,for å unngå dannelse av bobler, vennligst når pipetteringspipetteskalaen ble justert til 200 μl eller mindre.

Tabell 1-3:Legg til buffer ST

5. Lysatet brukes til påfølgende RT-qPCR-eksperimenter.Hvis de påfølgende eksperimentene ikke kan utføres i tide, må du holde den på is i ikke mer enn 2 timer, og lagre ved -20 ℃ eller -80 ℃ (ikke mer enn tre måneder).

B: Klargjøring av RT-system

1.Ta ut 5 × Direct RT Mix og legg den på et isbad, la den smelte naturlig og bland den forsiktig for senere bruk;ta ut RNase-Free ddH2O og smelt den og legg den på et isbad for senere bruk.Klargjør reaksjonssystemet på is i henhold til Tabell 2-1 nedenfor.

Tabell 2-1: Klargjøring av RT reaksjonssystem

2. Etter fullføring av systemformuleringen, blandes forsiktig og sentrifugeres kort i følgende tabell 2-2 reaksjonsbetingelser RT-reaksjon.

Tabell 2-2: Innstilling av RT-reaksjonstilstand

3.Etter fullføring av reaksjonen ble reaksjonsproduktet plassert direkte på is for qPCR, vennligst legg langtidskonserveringen -20 ℃ eller -80 ℃.

Merk: På grunn av bruken av ikke-renset mal, kan det forekomme hvite utfellinger i det omvendte transkripsjonsproduktet.Dette er et normalt fenomen.Sentrifuger supernatanten umiddelbart for påfølgende eksperimenter.

Den resulterende RT-reaksjonsløsningen tilsettes til neste trinn sanntids PCR-reaksjonssystemer, det anbefales å tilsette mengder som varierer fra 10-30 % av reaksjonssystemet.

C: forberedelse av qPCR-reaksjonssystem

1. Passende mengde B fremstilt i trinn cDNA-mal i henhold til følgende tabell 3-1 for å fremstille et reaksjonssystem.

Merk: Mengden cDNA-mal utgjør 10-30 % av qPCR-systemet.For eksempel, i et 20μl qPCR-system, tilsett 2-6 μl lyseringsbuffer, men ikke mer enn 6 μl.

2. Optimaliseringen gode qPCR-betingelser (glødetemperatur, etc.) for qPCR-reaksjon (reaksjonsbetingelsene gitt i tabell 3-2).

Merk: Prøv å bruke optimaliserte forhold for qPCR-reaksjoner for å få bedre resultater.

Tabell 3-1: Utarbeidelse av PCR-reaksjonssystem

1*: Primerkonsentrasjonen kan justeres i området 50-900 nM når primerreaksjonsytelsen er dårlig.

Merk: qPCR-systemet kan justeres i henhold til eksperimentelle behov og fluorescenssyklusmodell.For qPCR i en 50μl system, juster reagensdoseringen proporsjonalt i henhold til 20μl system.

2*: Velg riktig sluttkonsentrasjon av ROX Reference Dye i henhold til den kvantitative fluorescens-termiske syklusen.De mest passende ROX Reference Dye-konsentrasjonene for vanlige kvantitative fluorescenssyklere er vist i tabellen nedenfor:

Tabell 3-2: qPCR-reaksjonsbetingelser er gitt

Merk: For å oppnå den beste qPCR-effekten kan gradient-PCR brukes til å optimalisere reaksjonsforholdene for forskjellige maler og forskjellige primere.PCR-reaksjonsbetingelser varierer avhengig av fluorescensanalysator, mal, primer osv. I den spesifikke operasjonen må de optimale reaksjonsbetingelsene utformes i henhold til de spesifikke betingelsene for den fluorescens kvantitative termiske sykluseren, maltype, størrelsen på fragmentet av interesse, basesekvensen til det amplifiserte fragmentet og GC-innholdet og lengden på primerne, inkludert reaksjonstid, etc.

Real Time PCR primer designprinsipper

Forward Primer og Reverse Primer

For sanntids PCR er primerdesign veldig viktig.Primere er relatert til spesifisiteten og effektiviteten til PCR-amplifikasjon, og kan utformes med referanse til følgende prinsipper:

◆ Primerlengde: 18-30bp.

◆ GC-innhold: 40-60 %.

◆ Tm-verdi: Primer-designprogramvare, for eksempel Primer 5, kan gi Tm-verdien til primeren.Tm-verdiene til oppstrøms og nedstrøms primere bør være så nærme som mulig.Tm-beregningsformelen kan også brukes: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Når du utfører PCR, velges vanligvis en temperatur under primerens Tm-verdi på 5 °C som annealingstemperatur (den tilsvarende økningen i annealingstemperaturen kan øke spesifisiteten til PCR-reaksjonen).

◆ Primere og PCR-produkter:

◆ Design primer PCR amplifikasjonsproduktlengde er fortrinnsvis 100-150 bp.

◆ Designprimere i det sekundære strukturelle området av malen bør unngås så mye som mulig.

◆ Unngå dannelse av 2 eller flere komplementære baser mellom 3′-endene av oppstrøms- og nedstrømsprimere.

◆ Primer 3′ terminalbase kan ikke være til stede med 3 ekstra påfølgende G eller C.

◆ Primerne i seg selv kan ikke ha komplementære strukturer, ellers vil det dannes en hårnålsstruktur som påvirker PCR-amplifisering.

◆ ATCG bør fordeles så jevnt som mulig i primersekvensen, og den 3′ terminale basen bør unngås som T.

blindtarm1:Celler direkteRT-qPCR Kit komponentt tilleggspakke

1. Cellelyseløsning