Sterilisering av pipettespisser og EP-rør m.m.

1. Forbered 0,1 % (en tusendel) DEPC (svært giftig stoff) med avionisert vann, bruk det forsiktig i et avtrekksskap og oppbevar det ved 4°C unna lys;

DEPC-vann er rent vann behandlet med DEPC og sterilisert ved høy temperatur og høyt trykk.Testet for å være fri for RNase, DNase og proteinase.

2. Sett pipettespissen og EP-røret i 0,1 % DEPC, og sørg for at pipettespissen og EP-røret er fylt med 0,1 % DEP.

3. Beskytt mot lys, la stå over natten (12-24 timer)

4. Boksen som inneholder tuppen og EP-røret trenger ikke å ligge i DEPC.Etter å ha fjernet DEPC-vannet i spissen eller EP-røret grovt, pakk det sammen og pakk det inn.

5. 121 grader Celsius, 30min

6. 180 grader Celsius, tørk i flere timer (minst 3 timer)

Merk: a.Bruk latekshansker og masker ved håndtering av DEPC!b, eller uten DEPC-sterilisering, 130 ℃, 90 min autoklav (mange laboratorier høytemperatursterilisering to ganger)

RNA-ekstraksjonshensyn

To hovedfenomener med vevs-RNA-isolasjonssvikt

RNA-nedbrytning og rester av urenheter i vev,angående nedbrytning, la oss først se på hvorfor RNA ekstrahert fra dyrkede celler ikke lett brytes ned.Eksisterende RNA-ekstraksjonsreagenser inneholder alle komponenter som raskt hemmer RNase.Legg lysatet til de dyrkede cellene, og bland det ganske enkelt, alle cellene kan blandes grundig med lysatet, og cellene lyseres fullstendig.Etter at cellene er lysert, hemmer de aktive ingrediensene i lysatet umiddelbart den intracellulære RNase, slik at RNA forblir intakt.Det vil si at fordi de dyrkede cellene lett og fullstendig kommer i kontakt med lysatet, blir deres RNA ikke lett degradert;på den annen side brytes RNA i vevet lett ned fordi cellene i vevet ikke er lett å raskt komme i kontakt med lysatet.på grunn av tilstrekkelig kontakt.Så,forutsatt at det er en måte å gjøre vevet om til en enkelt celle mens den hemmer RNA-aktivitet, kan problemet med nedbrytning være fullstendig løst.

Fresing av flytende nitrogen er den mest effektive metoden.Fremgangsmåten med flytende nitrogen er imidlertid svært plagsom, spesielt når antallet prøver er stort.Dette ga opphav til det nest beste: homogenisatoren.Dehomogenisatormetoden vurderer ikke spørsmålet om hvordan RNase-aktivitet hemmes før cellene blir kontaktet med lysatet, men ber heller om at hastigheten på vevsforstyrrelser er raskere enn hastigheten som intracellulær RNase bryter ned RN.

Effekten av elektrisk homogenisator er bedre,og effekten av glasshomogenisator er dårlig, men generelt kan ikke homogenisatormetoden forhindre nedbrytningsfenomenet.Derfor, hvis ekstraksjonen er degradert, bør den originale elektriske homogenisatoren brukes til maling med flytende nitrogen;den originale glasshomogenisatoren bør endres til en elektrisk homogenisator eller males direkte med flytende nitrogen.Problemet er nesten 100 % gjennomførbart.få løst.

Problemet med urenhetsrester som påvirker etterfølgende eksperimenter har flere forskjellige årsaker enn nedbrytning, og løsningene er tilsvarende forskjellige.For å konkludere,hvis det er nedbrytning eller gjenværende urenheter i vevet, må ekstraksjonsmetoden/reagensen for det spesifikke forsøksmaterialet optimaliseres.Du trenger ikke å bruke de dyrebare prøvene dine for optimalisering: du kan kjøpe noen små dyr som fisk/kylling fra markedet, ta den tilsvarende delen av materialet for RNA-ekstraksjon, og den andre delen for proteinekstraksjon – male med munn-, mage- og tarmekstrakt.

Mål-RNA-en til det ekstraherte RNA-en brukes til forskjellige oppfølgingsforsøk, og kvalitetskravene er forskjellige

cDNA-bibliotekkonstruksjon krever RNA-integritet uten rester av enzymreaksjonsinhibitorer;Northern krever høyere RNA-integritet og lavere krav til rester av enzymreaksjonsinhibitorer;RT-PCR krever ikke for høy RNA-integritet,men hemmer enzymreaksjoner.Kravene til rester er strenge.Inngangen bestemmer utgangen;hver gang målet er å oppnå høyest renhet RNA, vil det koste folk og penger.

Samling/oppbevaring av prøver

Faktorer som påvirker nedbrytning Etter at prøven forlater den levende kroppen/eller det opprinnelige vekstmiljøet, vil de endogene enzymene i prøven begynne å bryte ned RNA,og nedbrytningshastigheten er relatert til innholdet av endogene enzymer og temperatur.Tradisjonelt er det bare to måter å fullstendig hemme endogen enzymaktivitet: tilsett lysat umiddelbart og homogeniser grundig og raskt;kutt i små biter og frys umiddelbart i flytende nitrogen.Begge tilnærmingene krever rask drift.Sistnevnte er egnet for alle prøver, mens førstnevnte kun er egnet for vev med lavt innhold av celler og endogene enzymer og lettere å homogenisere.Nærmere bestemt, plantevev, lever, thymus, bukspyttkjertel, milt, hjerne, fett, muskelvev osv. fryses best med flytende nitrogen før du fortsetter.

Fragmentering og homogenisering av prøver

Faktorer som påvirker nedbrytning og utbytte Prøvefragmentering erfor grundig homogenisering, som er for fullstendig og fullstendig frigjøring av RNA.Celler kan homogeniseres direkte uten å bli ødelagt.Vev kan bare homogeniseres etter å ha blitt brutt.Gjær og bakterier må brytes med tilsvarende enzymer før de kan homogeniseres.Vev med lavere endogent enzyminnhold og lettere homogenisering kan knuses og homogeniseres på en gang i lysatet med en homogenisator;plantevev, lever, thymus, bukspyttkjertel, milt, hjerne, fett, muskelvev og andre prøver, De er enten høye i endogene enzymer eller er ikke lett homogeniserte,så vevsforstyrrelse og homogenisering må utføres separat.Den mest pålitelige og mest produktive metoden for fragmentering er fresing med flytende nitrogen, og den mest pålitelige metoden for homogenisering er bruken av en elektrisk homogenisator.En spesiell merknad om fresing med flytende nitrogen: prøven må ikke tines under hele freseprosessen, siden det er mer sannsynlig at endogene enzymer fungerer når de fryses.

Valg av lysat

Påvirker brukervennligheten og faktorene til gjenværende endogene urenheter. De vanlig brukte lyseringsløsningene kan nesten hemme aktiviteten til RNase.Derfor er nøkkelen ved å velge en lyseringsløsning å vurdere i kombinasjon med rensemetoden.Det er ett unntak:prøver med høyt endogene enzyminnhold anbefales å bruke et lysat som inneholder fenol for å øke evnen til å inaktivere endogene enzymer.

Valg av rensemetode

Faktorer som påvirker gjenværende endogene urenheter, ekstraksjonshastighet For rene prøver som celler kan tilfredsstillende resultater oppnås med nesten hvilken som helst rensemetode for hånden.Men for mange andre prøver, spesielt de med høye nivåer av urenheter som planter, lever, bakterier osv., er det avgjørende å velge en passende rensemetode.Kolonnesentrifugalrensemetoden har en rask ekstraksjonshastighet og kan effektivt fjerne urenheter som påvirker den påfølgende enzymatiske reaksjonen av RNA, men den er dyr (Foregene kan tilby kostnadseffektive sett, mer detaljer klikkher);ved bruk av økonomiske og klassiske rensemetoder, som LiCl-utfelling, kan også oppnås tilfredsstillende resultater, men driftstiden er lang..

"Tre disipliner og åtte oppmerksomhet" for RNA-ekstraksjon

Disiplin 1:Sett en stopper for forurensning av eksogene enzymer.

Merknad 1:Bruk strengt masker og hansker.

Notat 2:Sentrifugerørene, spisshodene, pipettestavene, elektroforesetankene og eksperimentelle benkene som er involvert i eksperimentet, bør kastes grundig.

Merknad 3:Reagensene/løsningene som er involvert i eksperimentet, spesielt vann, må være RNase-frie.

Disiplin 2:Blokker aktiviteten til endogene enzymer

Merknad 4:Velg en passende homogeniseringsmetode.

Merknad 5:Velg et passende lysat.

Merknad 6:Kontroller startmengden til prøven.

Disiplin 3:Avklar utvinningsformålet ditt

Merknad 7:Med ethvert lysatsystem som nærmer seg den maksimale startmengden av prøven, faller suksessraten for ekstraksjon kraftig.

Merknad 8:Det eneste økonomiske kriteriet for vellykket RNA-ekstraksjon er en suksess i påfølgende eksperimenter, ikke utbytte.

Topp 10 kilder til RNase-kontaminering

1. Fingre er den første kilden til eksogene enzymer, så hansker må brukes og skiftes ofte.I tillegg må det også brukes masker, fordi pust også er en viktig kilde til enzymer.En ekstra fordel med å bruke hanskemaske er å beskytte forsøkspersonen.

2. Pipettespisser, sentrifugerør, pipetter – RNase kan ikke inaktiveres ved sterilisering alene, så pipettespisser og sentrifugerør bør behandles med DEPC, selv om de er merket som DEPC-behandlet.Det er best å bruke en spesialpipette, tørk av den med en bomullsdott med 75 % alkohol før bruk, spesielt stangen;pass på at du ikke bruker hodefjerner.

3. Vannet/bufferen må være fri for RNase-kontaminering.

4. Minst testbordet bør tørkes rent med 75 % alkohol bomullsboller.

5.Endogene RNase Alt vev inneholder endogene enzymer, så rask frysing av vev med flytende nitrogen er den beste måten å redusere nedbrytning på.Metoden for lagring/maling av flytende nitrogen er faktisk upraktisk, men det er den eneste måten for vev med høye nivåer av endogene enzymer.

6. RNA-prøver RNA-ekstraksjonsprodukter kan inneholde spor av RNase-kontaminering.

7. Plasmidekstraksjon Plasmidekstraksjon bruker ofte RNAse for å bryte ned RNA, og den resterende RNAse bør fordøyes med Proteinase K og ekstraheres med PCI.

8. RNA-lagring Selv om det oppbevares ved lav temperatur, vil spormengder av RNase forårsake RNA-nedbrytning.Den beste løsningen for langtidskonservering av RNA er en salt/alkoholsuspensjon, fordi alkohol hemmer all enzymatisk aktivitet ved lave temperaturer.

9. Når kationer (Ca, Mg) inneholder disse ionene, vil oppvarming ved 80C i 5 minutter føre til at RNA spaltes, så hvis RNA må varmes opp, må konserveringsløsningen inneholde et chelateringsmiddel (1mM natriumsitrat, pH 6,4).

10. Enzymer brukt i etterfølgende eksperimenter kan være kontaminert av RNase.

10 tips for RNA-ekstraksjon

1: Forhindre raskt RNase-aktivitet.Prøver fryses raskt etter innsamling, og RNase inaktiveres ved rask operasjon under lysering.

2: Velg en passende ekstraksjonsmetode for vev med høyt ribozyminnhold, og fettvev er best å bruke metoden som inneholder fenol.

3: Prediksjonskvalitet krever Northern, cDNA-bibliotekkonstruksjon krever høy integritet, og RT-PCR og RPA (Ribonuclease Protection Assay) krever ikke høy integritet.RT-PCR krever høy renhet (enzyminhibitorrester).

4: Grundig homogenisering er nøkkelen til å forbedre utbyttet og redusere nedbrytningen.

5: Sjekk integriteten til RNA-elektroforesedeteksjon, 28S: 18S = 2: 1 er et fullstendig tegn, 1: 1 er også akseptabelt for de fleste eksperimenter.

6: Fjerning av DNA for RT-PCR, array-analyse Det er best å bruke Dnase I for å fjerne DNA.

7: Reduser forurensning av eksogene enzymer – enzymer kan ikke importeres utenfra.

8: Ved konsentrering av lavkonsentrasjonsnukleinsyre bør en ko-utfellingsreagens tilsettes.Men for å forhindre at co-utfellingsmidlet inneholder enzymer og DNA-forurensning.

9: Løs RNA grundig, om nødvendig, varm opp til 65C i 5 minutter.

passende lagringsmetode

Den kan lagres ved –20C i kort tid, og ved –80C i lang tid.Det første trinnet i å forbedre RNA-utbyttet er å innse at RNA-innholdet i forskjellige prøver varierer veldig.Høy mengde (2-4 ug/mg) som lever, bukspyttkjertel, hjerte, middels mengde (0,05-2 ug/mg) som hjerne, embryo, nyre, lunge, thymus, eggstokk, lav mengde (<0,05 ug/mg) mg) som blære, bein, fett.

1: Lyser celler for å frigjøre RN – hvis RNA ikke frigjøres, vil utbyttet reduseres.Elektrisk homogenisering fungerer bedre enn andre homogeniseringsmetoder, men må kanskje også kombineres med andre metoder, som flytende nitrogenmesking, enzymatisk fordøyelse (Lysozyme/Lyticase)

2: Optimalisering av utvinningsmetoden.De største problemene med fenolbaserte metoder er ufullstendig stratifisering og delvis RNA-tap (supernatanten kan ikke fjernes fullstendig).Ufullstendig stratifisering skyldes høyt nukleinsyre- og proteininnhold, som kan løses ved å øke mengden lysat som brukes eller redusere prøvemengden.Et trinn med kloroformekstraksjon ble tilsatt til fettvevet.RNA-tap kan reduseres ved tilbakepumping eller ved å fjerne det organiske laget etterfulgt av sentrifugering.Det største problemet med kolonnesentrifugering-baserte metoder er overflødig prøve.

Klassiske utvinningstips

1. Fenolrensing: Tilsett et likt volum av 1:1 fenol/kloroform og bland kraftig i 1-2 minutter.Sentrifuger ved høy hastighet i 2 minutter.Fjern forsiktig supernatanten (80-90%).Kom aldri til mellomlaget.Et likt volum av reaksjonsløsningen kan tilsettes til fenol/kloroform og supernatanten fjernes.De to supernatantene kan blandes sammen for nukleinsyreutfelling for å forbedre utbyttet.Ikke vær for forsiktig når du blander, og ikke prøv å fjerne all supernatanten.

2. Vask med 70-80 % etanol: Under vask må nukleinsyren suspenderes for å sikre at restsaltet vaskes bort.Samtidig, umiddelbart etter å ha hellet av etanolen, sentrifuger ved høy hastighet i noen sekunder, og fjern deretter gjenværende etanol med en pipette.Løs opp etter å ha stått i romtemperatur i 5-10 minutter.

11. Utvinning av særorganisasjoner

1. Fibrøst vev: Nøkkelen til RNA-ekstraksjon fra fibrøst vev som hjerte/skjelettmuskulatur er å fullstendig forstyrre vevet.Disse vevene har lav celletetthet, så mengden RNA per vektenhet vev er lav, og det er best å bruke så mye startmengde som mulig.Sørg for å male vevet grundig under fryseforhold.

2. Vev med høyt protein/fettinnhold: hjerne/vegetabilsk fettinnhold er høyt.Etter PCI-ekstraksjon inneholder supernatanten hvite flokker.Supernatanten må ekstraheres på nytt med kloroform.

3. Vev med høyt nukleinsyre/ribozyminnhold: milten/thymus har høyt nukleinsyre- og ribozyminnhold.Å male vev under fryseforhold etterfulgt av rask homogenisering kan effektivt inaktivere ribozymer.Men hvis lysatet er for viskøst (på grunn av høyt nukleinsyreinnhold), vil PCI-ekstraksjonen ikke være i stand til å stratifisere effektivt;å legge til mer lysat kan løse dette problemet.Flere PCI-ekstraksjoner kan fjerne mer gjenværende DNA.Hvis det dannes et hvitt bunnfall umiddelbart etter tilsetning av alkohol, indikerer det DNA-kontaminering.Gjenekstraksjon med sur PCI etter oppløsning kan fjerne DNA-kontaminering.

4. Plantevev: Plantevev er mer komplekst enn dyrevev.Generelt males planter under flytende nitrogenforhold, så RNA-nedbrytning av endogene enzymer er uvanlig.Hvis nedbrytningsproblemet ikke er løst, er det nesten helt sikkert forårsaket av urenheter i prøven.Urenhetene som finnes i mange planter vil føre til rester, og årsaken til rester er ofte fordi disse urenhetene har noen likheter med RNA: du utfeller og jeg utfeller, og du adsorberer og jeg adsorberer.Disse egenskapene bestemmer at de er veldig sterke enzymhemmere.

For tiden kan kommersielle RNA-ekstraksjonsreagenser tilpasses til nesten alt dyrevev med små justeringer, men det er få kommersielle RNA-ekstraksjonsreagenser som kan være egnet for de fleste plantevev.Heldigvis kan Foregene gi spesielleplante-RNA-ekstraksjonssett, vi harPlant Total RNA isolasjonssett, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Sistnevnte er spesialdesignet for planter med høyt innhold av polysakkarid og polyfenol.For RNA-ekstraksjon er tilbakemeldinger fra laboratoriebrukere spesielt gode.

12. Effekten av prøvefrysing og tining Den frosne prøven kan være større, og den må kuttes før den brukes til RNA-ekstraksjon.Prøver har en tendens til å smelte (muligens delvis) under kutting.Frosne prøver må kanskje veies før RNA-ekstraksjon, og tining vil definitivt skje under denne prosessen.Noen ganger skjer opptining av prøven også under maleprosessen med flytende nitrogen;eller den frosne prøven tilsettes direkte til lysatet uten flytende nitrogenmaling, og tining vil definitivt skje før fullstendig homogenisering.Eksperimenter har vist at frosset vev er mer utsatt for RNA-nedbrytning under tining enn ferskt vev.Den sannsynlige årsaken: Fryse-tine-prosessen forstyrrer strukturer i cellen, noe som gjør det lettere for endogene enzymer å komme i direkte kontakt med RNA.

13. Vurdering av RNA-kvalitet Vanligvis brukes elektroforese for å bedømme integriteten til RNA, og A260/A280 brukes til å bedømme renheten til RNA.I teorien har intakt RNA et forhold på 28S:18S = 2,7:1, og de fleste data understreker forholdet 28S:18S = 2:1.Faktum er at nesten ingen av RNA ekstrahert fra andre prøver enn celler er i forholdet 2:1 (dette ble oppnådd ved bruk av Agilent Bioanalyzer).

Elektroforeseresultatene til RNA påvirkes av mange faktorer, inkludert sekundærstruktur, elektroforeseforhold, prøvebelastning, metningsgrad ved EB osv. Bruk naturlig elektroforese for å oppdage RNA og bruk DNA-markør som kontroll.Hvis 28S ved 2 kb og 18S ved 0,9 kb er klare, og 28S: 18S > 1, kan integriteten oppfylle kravene til de fleste påfølgende eksperimenter.

A260/A280 er en indikator som har skapt mye forvirring.Først av alt er det nødvendig å avklare den opprinnelige betydningen av denne indikatoren for nukleinsyrer: rent RNA, dets A260/280 = omtrent 2,0.Rent RNA er 'årsaken' og A260/A280 = 2 er 'effekten'.Nå bruker alle A260/A280 som en 'årsak', og tenker at "hvis A260/A280 = 2, så er RNA rent", noe som naturligvis fører til forvirring.

Hvis du er interessert, kan du legge til litt reagens som ofte brukes i ekstraksjon, som fenol, guanidin isotiocyanat, PEG, etc., til RNA-prøven din, og deretter måle A260/A280-forholdet.Realiteten er at mange av reagensene som brukes til RNA-ekstraksjon, så vel som mange urenheter i prøven, absorberer rundt A260 og A280, noe som påvirker A260/A280.

Den mest lærerike tilnærmingen for tiden er å skanne RNA-prøver i området 200-300 nm.Kurven til rent RNA har følgende egenskaper: kurven er glatt, A230 og A260 er to bøyningspunkter, A300 er nær 0, A260/A280 = rundt 2,0 og A260/A230 = rundt 2,0.Hvis skannedata ikke er tilgjengelig, må A260/A230-forholdet også bestemmes, da dette forholdet er mer følsomt for overføring av alle urenheter som påvirker den enzymatiske reaksjonen.Ta hensyn til enhetens lineære rekkevidde (0,1–0,5 for A260).

Det er to andre nyttige fenomener: forholdet vil være omtrent 0,3 lavere når A260/A280 måles i vann;mens forholdet målt i 10 mM EDTA er ca. 0,2 høyere enn det målt i 1 mM EDTA.

Relaterte produkter:

Kina Plant Total RNA Isolation Kit Produsent og leverandør |Foregene (foreivd.com)

RNA isolation series Leverandører og fabrikk |Kina RNA-isolasjonsserieprodusenter (foreivd.com)

RNA-isolasjonsserie – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)