RT-qPCR er utviklet fra vanlig PCR-teknologi.Den legger til fluorescerende kjemikalier (fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende prober) til det tradisjonelle PCR-reaksjonssystemet, og oppdager PCR-glødings- og forlengelsesprosessen i sanntid i henhold til deres forskjellige luminescerende mekanismer.Fluorescerende signalendringer i mediet brukes til å beregne mengden produktendring i hver PCR-syklus.For tiden er de vanligste metodene fluorescerende fargemetode og probemetode.

Fluorescerende fargemetode:
Noen fluorescerende fargestoffer, slik som SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., avgir ikke lys av seg selv, men sender ut fluorescens etter binding til det mindre sporet i dsDNA.Derfor, i begynnelsen av PCR-reaksjonen, kan ikke maskinen oppdage det fluorescerende signalet.Når reaksjonen fortsetter til annealing-forlengelse (to-trinns metode) eller forlengelsesstadium (tre-trinns metode), åpnes dobbelttrådene på dette tidspunktet, og den nye DNA-polymerasen Under trådsyntese kombineres fluorescerende molekyler i dsDNA-minor groove og sender ut fluorescens.Etter hvert som antallet PCR-sykluser øker, kombineres flere og flere fargestoffer med dsDNA, og det fluorescerende signalet forbedres også kontinuerlig.Ta SYBR Green Ⅰ som et eksempel.
Probemetode:
Taqman-sonden er den mest brukte hydrolysesonden.Det er en fluorescerende gruppe i 5′-enden av proben, vanligvis FAM.Selve sonden er en sekvens komplementær til målgenet.Det er en fluorescerende slukkegruppe ved 3′-enden av fluoroforen.I henhold til prinsippet om fluorescensresonansenergioverføring (Förster resonance energy transfer, FRET), når reporterfluorescensgruppen (donorfluorescerende molekyl) og den slukkende fluorescerende gruppen (akseptorfluorescerende molekyl) Når eksitasjonsspekteret overlapper og avstanden er svært nær (7-10 fluorescerende fluorescerende molekyl), akseptormolekylet, mens autofluorescensen er svekket.Derfor, i begynnelsen av PCR-reaksjonen, når proben er fri og intakt i systemet, vil ikke reporterfluorescensgruppen avgi fluorescens.Ved annealing binder primeren og proben seg til malen.Under forlengelsesstadiet syntetiserer polymerasen kontinuerlig nye kjeder.DNA-polymerase har 5′-3′ eksonukleaseaktivitet.Når den når proben, vil DNA-polymerasen hydrolysere proben fra malen, skille reporter-fluorescerende gruppen fra quencher-fluorescerende gruppen og frigjøre det fluorescerende signalet.Siden det er et en-til-en forhold mellom proben og malen, er probemetoden overlegen fargemetoden når det gjelder nøyaktigheten og følsomheten til testen.

Fig. 1 Prinsippet for QRT-PCR

Primer design
Prinsipper:

Primerne bør utformes i den konserverte regionen av nukleinsyreserien og ha spesifisitet.

Det er best å bruke cDNA-sekvens, og mRNA-sekvens er også akseptabel.Hvis ikke, finn ut cd-regiondesignet til DNA-sekvensen.
Lengden på det fluorescerende kvantitative produktet er 80-150bp, den lengste er 300bp, primerlengden er vanligvis mellom 17-25 baser, og forskjellen mellom oppstrøms- og nedstrømsprimerne bør ikke være for stor.

G+C-innholdet er mellom 40% og 60%, og 45-55% er best.
TM-verdien er mellom 58-62 grader.
Prøv å unngå primer-dimere og selvdimere, (ikke vises mer enn 4 par påfølgende komplementære baser) hårnålsstruktur, hvis uunngåelig, gjør ΔG<4,5kJ/mol* Hvis du ikke kan sikre at gDNA har blitt fjernet under revers transkripsjon. Rengjør, er det best å designe primerne til intronen og G′-enden til å unngå modifisert, G′- og G′-regionen. /C, A/G kontinuerlig struktur (2-3) primere og ikke-
spesifikk Homologien til den heterogent amplifiserte sekvensen er fortrinnsvis mindre enn 70 % eller har 8 komplementær basehomologi.
Database:
CottonFGD søk etter nøkkelord
Primer design:
IDT-qPCR primer design

Fig2 IDT online primer design verktøyside

Fig3 resultatsidevisning
Design av lncRNA-primere:
lncRNA:samme trinn som mRNA.
miRNA:Prinsippet for stem-loop-metoden: Siden alle miRNA-er er korte sekvenser på ca. 23 nt, kan ikke direkte PCR-deteksjon utføres, så stem-loop-sekvensverktøyet brukes.Stammeløkkesekvensen er et enkeltstrenget DNA på omtrent 50 nt, som kan danne en hårnålsstruktur av seg selv.3 'Enden kan utformes som en sekvens komplementær til miRNA-delfragmentet, deretter kan mål-miRNA-sekvensen kobles til stam-loop-sekvensen under revers transkripsjon, og den totale lengden kan nå 70bp, som er i tråd med lengden på det amplifiserte produktet bestemt av qPCR.Tailing miRNA primer design.
Amplifikasjonsspesifikk deteksjon:
Online blast database: CottonFGD blast etter sekvens likhet
Lokal blast: Se bruk Blast+ for å gjøre lokal blast, linux og Macos kan direkte etablere en lokal database, win10-systemet kan også gjøres etter installasjon av ubuntu bash.Lag lokal blast database og lokal blast;åpne ubuntu bash på win10.
Merk: Opplandsbomull og øybomull er tetraploide avlinger, så resultatet av sprengning vil ofte være to eller flere fyrstikker.Tidligere, bruk av NAU-cd-er som en database for å utføre blast vil sannsynligvis finne to homologe gener med bare noen få SNP-forskjeller.Vanligvis kan de to homologe genene ikke separeres med primerdesign, så de behandles som det samme.Hvis det er en åpenbar indel, er primeren vanligvis designet på indel, men dette kan føre til sekundærstrukturen til primeren. Den frie energien blir høyere, noe som fører til en reduksjon i amplifikasjonseffektiviteten, men dette er uunngåelig.

Påvisning av primer sekundær struktur:
Trinn:åpne oligo 7 → skriv inn malsekvens → lukk undervindu → lagre → finn primer på mal, trykk ctrl+D for å stille inn primerlengde → analyser ulike sekundære strukturer, som selvdimeriseringskropp, heterodimer, hårnål, mismatch osv. De to siste bildene i figur 4 er testresultatene av primerne.Resultatet av frontprimeren er bra, det er ingen åpenbar dimer og hårnålsstruktur, ingen kontinuerlige komplementære baser, og den absolutte verdien av fri energi er mindre enn 4,5, mens bakprimeren viser kontinuerlig De 6 basene er komplementære, og den frie energien er 8,8;i tillegg vises en mer alvorlig dimer i 3′-enden, og en dimer med 4 påfølgende baser vises.Selv om den frie energien ikke er høy, kan 3′ dimer Chl alvorlig påvirke amplifikasjonsspesifisitet og amplifikasjonseffektivitet.I tillegg er det nødvendig å se etter hårnåler, heterodimerer og uoverensstemmelser.

Fig3 oligo7 deteksjonsresultater
Deteksjon av forsterkningseffektivitet:
Amplifikasjonseffektiviteten til PCR-reaksjonen påvirker PCR-resultatene alvorlig.Også i qRT-PCR er amplifikasjonseffektiviteten spesielt viktig for de kvantitative resultatene.Fjern andre stoffer, maskiner og protokoller i reaksjonsbufferen.Kvaliteten på primerne har også stor innflytelse på amplifikasjonseffektiviteten til qRT-PCR.For å sikre nøyaktigheten av resultatene, må både den relative fluorescenskvantifiseringen og den absolutte fluorescenskvantifiseringen detektere amplifikasjonseffektiviteten til primerne.Det er anerkjent at den effektive qRT-PCR-amplifikasjonseffektiviteten er mellom 85 % og 115 %.Det er to metoder:
1. Standard kurvemetode:
en.Bland cDNA
b.Gradientfortynning
c.qPCR
d.Lineær regresjonsligning for å beregne amplifikasjonseffektiviteten
2. LinRegPCR
LinRegPCR er et program for analyse av sanntids RT-PCR Data, også kalt kvantitative PCR (qPCR) data basert på SYBR Green eller lignende kjemi.Programmet bruker ikke-grunnlinjekorrigerte data, utfører en grunnlinjekorreksjon på hver prøve separat, bestemmer et vindu-av-linearitet og bruker deretter lineær regresjonsanalyse for å passe en rett linje gjennom PCR-datasettet.Fra helningen til denne linjen beregnes PCR-effektiviteten til hver enkelt prøve.Gjennomsnittlig PCR-effektivitet per amplikon og Ct-verdi per prøve brukes til å beregne en startkonsentrasjon per prøve, uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter.Datainngang og -utgang skjer gjennom et Excel-regneark.Kun prøve
blanding er nødvendig, ingen gradient
trinn kreves:(Ta Bole CFX96 som et eksempel, ikke helt Maskin med tydelig ABI)
eksperiment:det er et standard qPCR-eksperiment.
qPCR datautgang:LinRegPCR kan gjenkjenne to former for utdatafiler: RDML eller kvantifiseringsforsterkningsresultat.Faktisk er det sanntidsdeteksjonsverdien til syklusnummeret og fluorescenssignalet av maskinen, og amplifikasjonen oppnås ved å analysere fluorescensendringens verdi for den lineære segmenteffektiviteten.
Datavalg: I teorien skal RDML-verdien være brukbar.Det anslås at problemet med datamaskinen min er at programvaren ikke kan gjenkjenne RDML, så jeg har excel-utdataverdien som originaldata.Det anbefales å utføre en grov screening av dataene først, for eksempel feil ved å legge til prøver, etc. Punktene kan slettes i utdataene (selvfølgelig kan du ikke slette dem, LinRegPCR vil ignorere disse punktene på et senere tidspunkt)

Fig5 qPCR dataeksport

Fig6 utvalg av kandidatprøver

Datainput:Åpne resultater for kvalifiseringsforsterkning.xls, → åpne LinRegPCR → fil → les fra excel → velg parametere som vist i figur 7 → OK → klikk på bestemme grunnlinjer

Fig7 trinn for linRegPCR-datainndata

Resultat:Hvis det ikke er noen repetisjon, er det ikke nødvendig med gruppering.Hvis det er repetisjon, kan grupperingen redigeres i prøvegrupperingen, og navnet på genet legges inn i identifikatoren, og da vil det samme genet automatisk grupperes.Til slutt klikker du på filen, eksporterer Excel og viser resultatene.Amplifikasjonseffektiviteten og R2-resultatene for hver brønn vil vises.For det andre, hvis du deler inn i grupper, vil den korrigerte gjennomsnittlige forsterkningseffektiviteten vises.Sørg for at amplifikasjonseffektiviteten til hver primer er mellom 85 % og 115 %.Hvis den er for stor eller for liten, betyr det at amplifikasjonseffektiviteten til primeren er dårlig.

Fig 8 Resultat og datautgang

Eksperimentell prosess:
RNA kvalitetskrav:
Renhet:1.72,0 indikerer at det kan være rester av isotiocyanat.Ren nukleinsyre A260/A230 bør være rundt 2. Hvis det er sterk absorpsjon ved 230 nm, indikerer det at det finnes organiske forbindelser som f.eks. fenationer.I tillegg kan det påvises ved 1,5 % agarosegelelektroforese.Pek på markøren, fordi ssRNA ikke har noen denaturering og molekylvektslogaritmen ikke har en lineær sammenheng, og molekylvekten kan ikke uttrykkes korrekt.Konsentrasjon: Teoretiskikkemindre enn 100 ng/ul, hvis konsentrasjonen er for lav, er renheten generelt lav ikke høy

Fig9 RNA gel

I tillegg, hvis prøven er verdifull og RNA-konsentrasjonen er høy, anbefales det å alikvotere den etter ekstraksjon, og fortynne RNA til en sluttkonsentrasjon på 100-300 ng/ul for revers transkripsjon.Iprosessen med omvendt transkripsjon, når mRNA transkriberes, brukes oligo (dt) primere som spesifikt kan binde seg til polyA haler for revers transkripsjon, mens lncRNA og circRNA bruker random hexamer (Random 6 mer) primere for revers transkripsjon av total RNA For miRNA brukes miRNA-spesifikke neck-loop reverse primere.Mange selskaper har nå lansert spesielle tailing-sett.For stem-loop-metoden er tailing-metoden mer praktisk, høy gjennomstrømning og reagensbesparende, men effekten av å skille miRNA-er fra samme familie bør ikke være like god som stem-loop-metoden.Hvert revers transkripsjonssett har krav til konsentrasjonen av genspesifikke primere (stammeløkker).Den interne referansen som brukes for miRNA er U6.I prosessen med stamme-løkke-inversjon, bør et rør med U6 reverseres separat, og front- og bakprimerne til U6 bør legges direkte.Både circRNA og lncRNA kan bruke HKGs som intern referanse.IcDNA-deteksjon,
hvis det ikke er noe problem med RNA, bør cDNA også være i orden.Men hvis perfeksjon av eksperimentet etterstrebes, er det best å bruke et internt referansegen (Reference gen, RG) som kan skille gDNA fra cd-er.Generelt er RG et husholdningsgen.HKG) som vist i figur 10;På den tiden laget jeg lagringsprotein for soyabønner, og brukte actin7-inneholdende introner som en intern referanse.Størrelsen på det amplifiserte fragmentet av denne primeren i gDNA var 452 bp, og hvis cDNA ble brukt som en mal, var den 142 bp.Deretter fant testresultatene at en del av cDNA faktisk var kontaminert av gDNA, og det viste også at det ikke var noe problem med resultatet av revers transkripsjon, og det kunne brukes som mal for PCR.Det er ubrukelig å kjøre agarosegelelektroforese direkte med cDNA, og det er et diffust bånd, som ikke er overbevisende.

Fig. 10 cDNA-deteksjon

Bestemmelsen av qPCR-forholder generelt ikke noe problem i henhold til protokollen til settet, hovedsakelig i trinnet tm-verdi.Hvis noen primere ikke er godt utformet under primerdesign, noe som resulterer i en stor forskjell mellom tm-verdien og den teoretiske 60°C, anbefales det at cDNA Etter at prøvene er blandet, kjører du en gradient-PCR med primere, og prøver å unngå å sette temperaturen uten bånd som TM-verdi.

Dataanalyse

Den konvensjonelle relative fluorescens kvantitative PCR-prosesseringsmetoden er i utgangspunktet i henhold til 2-ΔΔCT.Databehandlingsmal.

Relaterte produkter:

Sanntids PCR Enkel^TM –Taqman

Sanntids PCR Enkel^TM –SYBR GRØNN I

RT Easy I (Master Premix for første streng cDNA-syntese)

RT Easy II (Master Premix for første streng cDNA syntese for qPCR)