RT-qPCR-eksperiment inkluderer RNA-ekstraksjon og kvalitetsvurdering, revers transkripsjon og qPCR tre trinn, hvert trinn har mange forholdsregler, vi vil introdusere i detalj nedenfor.

Ⅰ.RNA kvalitetsvurdering

I RT-qPCR-eksperiment, etter fullføring av RNA-ekstraksjon, må kvaliteten på RNA evalueres, og oppfølgingseksperimentet kan bare utføres etter at det er kvalifisert.Evalueringsmetoder inkluderer spektrofotometer, Agilent gelelektroforese, Agilent 2100-analyse, blant annet det mest brukte spektrofotometeret og agarosegelelektroforesemetoden.Det skal bemerkes at disse to metodene må brukes sammen for å fullføre deteksjon og analyse av RNA-konsentrasjon, renhet og integritet, for å sikre kvaliteten på RNA.

Relatert RNA-isolasjonssett: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Høyrenset og høykvalitets total-RNA kan fås fra forskjellige dyrkede celler på 11 minutter.

Animal Total RNA Isolation Kit

Raskt og effektivt ekstraherer høy renhet og høykvalitets total-RNA fra forskjellige dyrevev.

Spektrofotometer:

Spektrofotometeret brukes hovedsakelig til å bestemme konsentrasjonen og renheten til RNA, men det kan ikke oppdage integriteten til RNA og genomiske rester.Blant dem er A260/280 og A260/230 viktige parametere for påvisning av RNA-renhet, og RNA-renhet kan påvises i henhold til svingningene i verdiene deres:

1. 1.9< A260/280< 2.1, noe som indikerer at RNA-renheten er god;A260/280<1,9, noe som indikerer at det kan være proteinrester i RNA;A260/280>2.1, som indikerer mulig delvis nedbrytning av RNA, som kan bekreftes ytterligere ved agarosegelelektroforese.

2. 2.0< A260/230< 2.2, noe som indikerer at RNA-renheten er god;A260/230< 2,0, noe som indikerer at det kan være rester av organiske reagenser i RNA, slik som fenoler, etanol eller sukker.

Agarosegelelektroforese:

Agarosegelelektroforeseanalyse kan analysere RNA-integritet, genom- og proteinrester, men kan ikke nøyaktig kvantifisere konsentrasjonen av RNA eller oppdage restene av organiske reagenser.Ta for eksempel eukaryote RNA-maler:

1. RNA ble utsatt for agarosegelelektroforese.Hvis det bare var tre enkeltbånd av 28sRNA, 18sRNA og 5.8sRNA på gelkartet, indikerer det at det ekstraherte RNA er intakt.Hvis det er et dragfenomen, indikerer det delvis nedbrytning av RNA.

2. Hvis det er et enkelt lyst bånd mellom limhullet og 28sRNA-båndet, kan det være genomisk DNA-rester.

3. Hvis det kommer bånd i limhullet, indikerer det at det kan være rester av protein og andre makromolekylære stoffer.

Ⅱ. Omvendt transkripsjon

Etter at RNA-ekstraksjon er fullført, må den reverseres til cDNA for påfølgende eksperimenter, så reverseringstrinnet er avgjørende.Revers transkripsjon vil bli introdusert fra utvalget av revers transkriptase og primer:

Valg av omvendt transkriptase:

De typiske revers transkriptasene inkluderer AMV RTase og MMLV RTase.RNase H til AMV RTase har sterk aktivitet, kort synteselengde, lav syntesemengde og god termisk stabilitet (42 ~ 55 ℃).RNase H-aktiviteten til MMLV RTase er svak, synteselengden er lang, syntesemengden er høy og den termiske stabiliteten er dårlig (37 ~ 42 ℃).

Fordi RNase H-enzym har funksjonen til å bryte ned RNA-template, bør MMLV med svak RNase H-aktivitet fortrinnsvis velges under revers transkripsjon, og etter senere genteknologi har den termiske stabiliteten til MMLV nådd et kvalitativt sprang.Tar ForegeneForeasy revers transkriptase (M-MLV for revers transkripsjon) som et eksempel er det en ny revers transkriptase uttrykt i E. coli-konstruerte bakterier ved bruk av genetisk rekombinasjonsteknologi.Det er en rekombinant DNA-polymerase som syntetiserer en komplementær DNA-streng fra enkelttrådet RNA, DNA eller en RNA:DNA-hybrid.Den har ingen RNase H-aktivitet, sterk stabilitet, sterk RNA-affinitet og høy deteksjonsfølsomhet.

 

Foreasy revers transkriptase (M-MLV for revers transkripsjon)

Valg av primer:

Generelt faller RT-primere i tre kategorier: oligo dT, tilfeldige primere og genspesifikke primere.Velg passende primere for bruk i henhold til forskjellige eksperimentelle krav.

1. Hvis malen er av eukaryot opprinnelse og sen cDNA brukes til rutinemessig PCR-amplifisering, anbefales Oligo (dT);Hvis det påfølgende eksperimentet bare brukes til qPCR, anbefales Oligo (dT) å blandes med tilfeldige primere for å forbedre effektiviteten av revers transkripsjon.

2. Hvis malen er fra prokaryoter, bør tilfeldige primere eller genspesifikke primere velges for revers transkripsjon.

Ⅲ.qPCR

Fluorescenskvantifisering er hovedsakelig utarbeidet fra valg av kvantitative metoder, primerdesignprinsipper, ROX-valg, reaksjonssystemkonfigurasjon og innstilling av reaksjonsbetingelser, etc.

Valg av kvantitative metoder:

Kvantitative metoder er delt inn i relative kvantitative metoder og absolutte kvantitative metoder.Relativ kvantifisering kan brukes til å påvise effekten av visse behandlingsmetoder på genuttrykk, påvise forskjellen i genuttrykk til forskjellige tider og sammenligne forskjellen på genuttrykk i forskjellige vev.Absolutt kvantifisering kan oppdage mengden nukleinsyre i viruset og så videre.Når vi gjør eksperimenter, må vi velge passende kvantitative metoder i henhold til våre egne eksperimenter.

Primer designprinsipper:

Utformingen av primer for qPCR er direkte relatert til amplifikasjonseffektiviteten og produktspesifisiteten.Derfor er riktig utforming av gode primere det første trinnet i vellykket qPCR.Ved utforming av primer bør følgende prinsipper tas hensyn til når man oppfyller prinsippet om konvensjonell primerdesign:

1. Lengden på målfragmentet kontrolleres mellom 100 og 300 bp;

2. Cross-exon design for å unngå påvirkning av genomisk DNA;

3. De utformede primerne må testes for amplifikasjonseffektivitet, og bare når amplifikasjonseffektiviteten når standarden (90-110%) kan de brukes til kvantitative eksperimenter;

4. Primerkonsentrasjonen er vanligvis optimalisert mellom 0,1 uM og 1,0 uM.

Utvalg avROX:

I prosessen med kvantitativ reaksjon kan ROX justere den optiske baneforskjellen, pipetteringsfeilen eller volumforskjellen forårsaket av fordampning og kondensering jevnt, og forbedre repeterbarheten av resultatene.Det skal imidlertid bemerkes at valget av ROX er relatert til instrumentet.Hvis qPCR-instrumentet har funksjonen til å automatisk korrigere forskjellen mellom hullene, trenger det ikke å legge til ROX;ellers må den legge til ROX-korreksjon.Små partnere i å kjøpe reagenser må være i henhold til instrumentet som brukes for å velge riktig ROX, unngå senere feil.

Klargjøring av reaksjonssystem:

Reaksjonsvolumer på 20 ul og 50 ul er foretrukket.Følgende forhold bør tas hensyn til når systemet utformes:

1. Reaksjonssystemet må klargjøres ved ventilasjon i den ultrarene arbeidsbenken, ny ddH₂O brukes for hvert eksperiment;

2. Hvert eksperiment må forberede NTC for å verifisere om det er forurensning i systemet, og hvert par primere må gjøre NTC når systemet klargjøres;

3. For å oppdage om det er gDNA-rester i RNA-malen, kan NRT forberedes for hver prøve for deteksjon;

4. Ved klargjøring av systemet anbefales det å gjøre minst 3 tekniske repetisjoner for en prøve;

5. Når malen er cDNA, anbefales det å fortynne 5-10 ganger for å redusere inhiberingseffekten av revers transkripsjonssystem på qPCR-eksperiment.Det er bedre å utforske malmengden etter gradient, slik at CT-verdien faller mellom 20-30;

6. Bestem det nødvendige antall reaksjoner, øk med 5-10% på grunnlag av antall reaksjoner, og beregn volumkonfigurasjonstallet;

7, systemet er forberedt ved å bruke premix-prinsippet, blande etter sentrifugering og sikre ingen bobler;

8, Så langt det er mulig å velge støttende forbruksvarer.

Relatert RT-qPCR-sett