RT-qPCR er det grunnleggende eksperimentet innen molekylærbiologi, og alle må være kjent med det.Den inkluderer hovedsakelig tre trinn: RNA-ekstraksjon, revers transkripsjon til cDNA og sanntids fluorescerende kvantitativ PCR.Det hjelper ikke, hva skjer?Det er sannsynlig at det er et problem medeksperimentet med omvendt transkripsjon!Selv om det ser ut til at revers transkripsjonseksperimentet bare trenger å legge til RNA, dNTP, primere ogrevers transkriptasetil sentrifugerøret og bland godt, men i selve operasjonsprosessen er det fortsatt mange detaljer som må tas hensyn til.La oss lære om det!

Hvordan bedømme kvaliteten på RNA?
For å få cDNA er kvaliteten på RNA avgjørende!RNA-kvalitet kan påvises hovedsakelig fra to aspekter:
(1) RNA-integritet:RNA-integritet kan verifiseres ved agarosegelelektroforese. Ta eukaryoter som et eksempel, det komplette totale RNA har tre klare bånd, molekylvektene fra stor til liten er 28S, 18S og 5S, og 28S er dobbelt så lyssterk som 18S;hvis tre bånd kan sees, men båndtypen er uskarp eller diffusjon betyr at RNA er delvis degradert.På dette tidspunktet, utfør omvendt transkripsjonsreaksjon umiddelbart og øk malinndataene på riktig måte;hvis bare et bånd med liten molekylvekt eller ingen bånd kan sees, har RNA blitt fullstendig degradert og må ekstraheres på nytt.Agilent 2100 indikerer integriteten til RNA med toppdiagram og RIN-verdi.Hvis nukleinsyren er intakt, er grunnlinjen til elektroferogrammet flat;hvis nukleinsyren er alvorlig degradert, er grunnlinjen ujevn og flere nedbrytningstopper vises;verdien av RIN gjenspeiler integriteten til RNA, innenfor området 0-10, jo større verdi, jo bedre er kvaliteten på RNA.Vel, jo høyere grad av fullstendighet.
(2) Renhet av RNA:Forholdet mellom OD260/280 kan detekteres ved UV-spektrofotometri.Hvis forholdet mellom OD260/280 er mellom 1,9 og 2,1, er renheten meget god.
Gjenværende genomisk DNA kan føre til unøyaktige kvantitative resultater
Når RNA ekstraheres, kan RNA vi får blandes med genomisk DNA (gDNA) som ikke er renset.Derfor vil cDNA etter revers transkripsjon også blandes medgDNA.Under nedstrømsqPCRreaksjon,cDNAog gDNA kan amplifiseres samtidig, noe som resulterer i en relativt liten CT-verdi, slik at resultatene kan være partiske.
Så hva bør vi gjøre i denne situasjonen?Foregeneforeslår:
(1) Utfør genomrensing på det reverserte RNA, som kan fjernes ved kolonneekstraksjon under RNA-ekstraksjon;
(2) Behandle det ekstraherte RNA med DNaseI , men avslutt det med EDTA;
av revers transkripsjonsreagensermed genomrydningsmoduler;

Hvordan velge primere for revers transkripsjon?
Revers transkripsjonsprimere påvirker også resultatet av revers transkripsjonsreaksjonen.Du kan velge tilfeldige primere, Oligo dT eller genspesifikke primere for revers transkripsjon i henhold til de spesifikke omstendighetene for eksperimentet:
(1) Spesifikke utskrifter: genspesifikke primere anbefales;
(2) Lange fragmentavskrifter: Oligo dT/genspesifikke primere anbefales;
(3) Interne fragmenter av langsegmentutskrifter: genspesifikke primere/ tilfeldige primere/tilfeldige primere + Oligo dT.Hvis det påfølgende qPCR-eksperimentet utføres, kan ikke Oligo dT brukes alene, fordi bruk av Oligo dT alene kan forårsake 3′-endeskjevhet, noe som fører til unøyaktige qPCR-eksperimentresultater;
(4) miRNA: Stam-loop-primere eller tailing-primere kan brukes.

Hvor mange ganger bør revers transkripsjonsproduktet cDNA fortynnes for kvantifisering?
Etter å ha oppnådd cDNA for revers transkripsjonsproduktet, er det veldig viktig hvor mange ganger cDNA skal fortynnes for qPCR-eksperimenter.Hvis cDNA-konsentrasjonen er for høy eller for lav, kan amplifikasjonseffektiviteten bli påvirket.Kan cDNA-konsentrasjonen måles, og hvordan bør det gjøres?
(1) cDNA-konsentrasjonen til revers transkripsjonsproduktet kan ikke måles, fordi i tillegg til cDNA-produktet inneholder revers transkripsjonsproduktet også revers transkripsjonsrestbuffer, revers transkriptase, primere, etc., som vil interferere med konsentrasjonsmålingsresultatene og forårsake OD260/280, OD260/260 reflekterer derfor ikke cD260-forholdet.På dette tidspunktet vil noen venner si, så vil jeg måle konsentrasjonen etter rensing;Her vil Foregene minne om at cDNA ikke anbefales å renses, fordi lengden på cDNA oppnådd ved reverseringen er forskjellig, og det korte cDNAet vil gå tapt i rensingen.
(2) Så hva skal jeg gjøre?Før qPCR-eksperimentet kan fortynningsgradienten til cDNA bestemmes gjennom pre-eksperimentet.For eksempel: bruk cDNA-stamløsning, 10 ganger fortynning og 100 ganger fortynning som maler for qPCR-eksperimenter, og velg fortynningsfaktoren med en CT-verdi i området 18-28.

Hvordan skal miRNA-er reverstranskriberes?
miRNA er et enkeltstrenget lite molekyl-RNA med en størrelse på ca. 22 nt som ikke koder for protein.På grunn av sin korte lengde, er konvensjonell qPCR-metode vanskelig å direkte kvantifisere den, så det er ofte nødvendig å utvide miRNA;de ofte brukte revers transkripsjonsmetodene for miRNA inkluderer stem-loop-metoden og tailing-metoden.
Stem-loop-metoden er å utvide miRNA ved å legge til stem-loop-primere.Denne deteksjonsmetoden har høyere sensitivitet og spesifisitet, men deteksjonsgjennomstrømningen er lav.Én revers transkripsjon kan bare oppdage ett miRNA og en intern referanse;hale-tilleggsmetoden er sammensatt av to. Den fullføres ved felles handling av to enzymer, som er PolyA-polymerase og revers transkriptase.PolyA-polymerase er ansvarlig for å legge PolyA-haler til miRNA for å øke lengden, og revers transkriptase utfører omvendt transkripsjonsreaksjon.Denne metoden har høy deteksjonsgjennomstrømning og kan oppdage flere miRNA-er og interne referanser i en revers transkripsjon, men sensitiviteten og spesifisiteten er lav i stem-loop-metoden.