Real Time PCR, også kjent som kvantitativ PCR eller qPCR, er en metode for sanntidsovervåking og analyse av PCR-amplifikasjonsprodukter.
Fordi kvantitativ PCR har fordelene med enkel betjening, rask og praktisk, høy sensitivitet, god repeterbarhet og lav kontamineringshastighet, er den mye brukt i medisinsk testing, vurdering av medikamenteffektivitet, genuttrykksforskning, transgen forskning, gendeteksjon, patogendeteksjon, dyr- og plantedeteksjon., mattesting og andre felt.
Derfor, enten du er engasjert i grunnleggende forskning innen biovitenskap, eller ansatte i farmasøytiske selskaper, dyreholdsselskaper, næringsmiddelbedrifter, eller til og med ansatte ved innreise-utreisekontroll og karantenebyråer, miljøovervåkingsavdelinger, sykehus og andre enheter, vil du bli mer eller mindre utsatt for Eller du trenger å kjenne til kunnskapen om å mestre kvantitativ PCR.

Prinsippet for sanntids PCR

Real Time PCR er en metode der fluorescerende stoffer tilsettes PCR-reaksjonssystemet, og fluorescenssignalintensiteten i prosessen med PCR-reaksjon overvåkes i sanntid av et kvantitativt PCR-instrument, og til slutt analyseres og behandles de eksperimentelle dataene.

【Amplifikasjonskurve】er kurven som beskriver den dynamiske prosessen med PCR.Amplifikasjonskurven til PCR er egentlig ikke en standard eksponentiell kurve, men en sigmoidkurve.

[Plattform fase av amplifikasjonskurve]Med økningen i antall PCR-sykluser, inaktiveringen av DNA-polymerase, uttømmingen av dNTP-er og primere, og inhiberingen av syntesereaksjonen av reaksjonsbiproduktet pyrofosfat, etc., utvides ikke PCR alltid eksponentielt., og vil til slutt gå inn på et platå.

[Eksponentiell vekstregion for amplifikasjonskurve]Selv om platåfasen varierer sterkt, er repeterbarheten svært god i en viss region av den eksponentielle vekstregionen til amplifikasjonskurven, noe som er svært viktig for kvantitativ analyse av PCR.

[Terskelverdi og Ct-verdi]Vi setter grenseverdien for fluorescensdeteksjon på passende posisjon i det eksponentielle vekstområdet til amplifikasjonskurven, nemlig terskelverdien (Threshold).Skjæringspunktet mellom terskelverdien og forsterkningskurven er Ct-verdien, det vil si at Ct-verdien refererer til antall sykluser (Threshold Cycle) når terskelverdien er nådd.

Grafen nedenfor viser tydelig forholdet mellom terskellinje og amplifikasjonskurve, terskel og Ct-verdi.

【Hvordan kvantifisere?】

Det har blitt bevist av matematisk teori at Ct-verdien har et inverst lineært forhold til logaritmen til antall innledende maler.Real Time PCR overvåker PCR-amplifikasjonsprodukter i sanntid og kvantifiserer dem under den eksponentielle amplifikasjonsfasen.

For hver PCR-syklus økte DNA eksponentielt med 2 ganger, og nådde snart et platå.

Forutsatt at mengden start-DNA er A₀ , etter n sykluser, kan den teoretiske mengden av DNA-produkt uttrykkes som:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Deretter, jo mer den opprinnelige DNA-mengden A 0 er, jo raskere når mengden av det amplifiserte produktet deteksjonsverdien An, og antall sykluser når man når An er Ct-verdien.Det vil si at jo mer den opprinnelige DNA-mengden A 0 er, jo tidligere topper amplifikasjonskurven, og tilsvarende er det nødvendige antall sykluser n mindre.

Vi utfører gradientfortynning av standarden med kjent konsentrasjon og bruker den som en mal for sanntids PCR, og en serie amplifikasjonskurver vil bli oppnådd med like intervaller i rekkefølgen av start-DNA-mengde fra mer til mindre.I henhold til det lineære forholdet mellom Ct-verdien og logaritmen til antall startmaler, a[standardkurve] kan opprettes.

Ved å erstatte Ct-verdien til prøven med ukjent konsentrasjon i standardkurven, kan den innledende malmengden av prøven med ukjent konsentrasjon oppnås, som er det kvantitative prinsippet for sanntids-PCR.

Deteksjonsmetode for sanntids PCR

Real Time PCR detekterer PCR-amplifikasjonsprodukter ved å detektere fluorescensintensiteten i reaksjonssystemet.

Prinsippet for fluorescerende fargeinnleiringsmetode】

Fluorescerende fargestoffer, slik som TB Green®, kan ikke-spesifikt binde seg til dobbelttrådet DNA i PCR-systemer og fluorescere ved binding.

Fluorescensintensiteten i reaksjonssystemet økte eksponentielt med økningen av PCR-sykluser.Ved å detektere fluorescensintensiteten kan mengden DNA-amplifikasjon i reaksjonssystemet overvåkes i sanntid, og deretter kan mengden av startmalen i prøven estimeres omvendt.

【Prinsippet for fluorescerende probemetode】

fluorescerende sondeer en nukleinsyresekvens med en fluorescerende gruppe i 5'-enden og en quenching-gruppe i 3'-enden, som spesifikt kan binde seg til malen.Når proben er intakt, slukkes fluorescensen som sendes ut av fluoroforen av den slukkende gruppen og kan ikke fluorescere.Når sonden dekomponeres, vil det fluorescerende stoffet dissosiere og avgi fluorescens.

En fluorescerende probe tilsettes PCR-reaksjonsløsningen.Under annealingsprosessen vil den fluorescerende proben binde seg til den spesifikke posisjonen til malen.Under forlengelsesprosessen kan 5′→3′ eksonukleaseaktiviteten til PCR-enzymet dekomponere den fluorescerende proben hybridisert med malen, og den fluorescerende substansen dissosieres for å avgi fluorescens.Ved å detektere fluorescensintensiteten til proben i reaksjonssystemet, kan formålet med å overvåke amplifikasjonsmengden til PCR-produktet oppnås.

【Valg av fluorescensdeteksjonsmetode】

Hvis den brukes til å skille sekvenser med høy homologi og utføre multipleks PCR-deteksjon som SNP-typeanalyse, er den fluorescerende probemetoden uerstattelig.
For andre sanntids PCR-eksperimenter kan en enkel, lett og rimelig fluorescerende kimærmetode brukes.

prober Sterk spesifisitet, i stand til multipleks PCR

Mangel

Høye spesifisitetskrav for forsterkning;

multipleks PCR kan ikke utføres Behov for å designe spesifikke prober, høye kostnader;

noen ganger er sondedesign vanskelig

Relaterte produkter: