Det er velkjent at i det sentrale dogmet er RNA den transkripsjonelle mediatoren mellom DNA og proteinekspresjon.Sammenlignet med påvisning av DNA, kan påvisning av RNA mer objektivt reflektere genuttrykket i organismer.Eksperimenter som involverer RNA inkluderer: qRT-PCR, RNA-Seq og fusjonsgendeteksjon osv. Basert på egenskapene til RNA selv (sukkerringen til RNA har en mer fri hydroksylgruppe enn sukkerringen til DNA), kombinert med et stort antall RNaser i miljøet, er RNA mer ustabilt og lettere å brytes ned enn DNA.Søppel inn, søppel ut, hvis kvaliteten på RNA ikke er god, må de eksperimentelle resultatene være utilfredsstillende, spesifikt manifestert som unøyaktige data eller dårlig repeterbarhet.Derfor bør mer oppmerksomhet rettes mot behandlingen av RNA, og koblingen til kvalitetskontroll er også viktigere for å sikre presisjonen og nøyaktigheten til påfølgende eksperimentelle data.

For kvalitetskontroll av RNA er det vanligvis følgende metoder som ofte brukes:

• Spektrofotometri
• agarosegelelektroforese
• Agilent Bioanalyzer
• sanntids fluorescerende kvantitativ PCR
• Qubit fluorescerende fargemetode

01 Spektrofotometri

RNA har konjugerte dobbeltbindinger og har en absorpsjonstopp ved en bølgelengde på 260nm.I henhold til Lambert-Beers lov kan vi beregne RNA-konsentrasjonen fra absorpsjonstoppen ved 260nm.I tillegg kan vi også beregne renheten til RNA i henhold til forholdet mellom 260nm, 280nm og 230nm absorpsjonstopper.280nm og 230nm er absorpsjonstoppene til henholdsvis proteiner og små molekyler.Forholdet mellom A260/A280 og A260/A230 av kvalifisert RNA-renhet bør være større enn 2. Hvis det er mindre enn 2, betyr det at det er protein- eller småmolekylforurensning i RNA-prøven og må renses på nytt.Forurensningskilder vil påvirke nedstrøms eksperimenter, slik som å hemme amplifikasjonseffektiviteten til PCR-reaksjoner, noe som resulterer i unøyaktige kvantitative resultater.Renheten til RNA har stor innflytelse på etterfølgende resultater, så spektrofotometri er generelt en uunnværlig kvalitetskontrollkobling i det første trinnet i nukleinsyreeksperimenter.

Figur 1. Typisk RNA/DNA-absorpsjonsspektrum

02 Agarosegelelektroforese

I tillegg til renhet er integriteten til RNA også en av de viktige indikatorene for å bedømme kvaliteten på RNA.Nedbrytningen av RNA vil føre til et stort antall korte fragmenter i prøven, så antallet RNA-fragmenter som effektivt kan påvises og dekkes av referansesekvensen vil reduseres.RNA-integritet kan kontrolleres ved elektroforese av totalt RNA på en 1% agarosegel.Denne metoden kan konfigurere gelen selv, eller bruke det prefabrikerte E-Gel™-systemet for integritetstesting.Mer enn 80 % av totalt RNA er ribosomalt RNA, hvorav flertallet er sammensatt av 28S og 18S rRNA (i pattedyrsystemer).RNA av god kvalitet vil vise to tydelige lyse søyler, som er henholdsvis 28S og 18S lyse søyler ved 5 Kb og 2 Kb, og forholdet vil ha en tendens til å være nær 2:1.Hvis den er i diffus tilstand betyr det at RNA-prøven kan ha blitt degradert, og det anbefales å bruke metoden beskrevet senere for å teste kvaliteten på RNA ytterligere.

Figur 2. Sammenligning av nedbrutt (bane 2) og intakt RNA (felt 3) på agarosegelelektroforese

03 Agilent Bioanalyzer

I tillegg til agarosegelelektroforesemetoden beskrevet ovenfor, som kan hjelpe oss med å identifisere integriteten til RNA enkelt og raskt, kan vi også bruke Agilent bioanalyzer for å bestemme integriteten til RNA.Den bruker en kombinasjon av mikrofluidikk, kapillærelektroforese og fluorescens for å vurdere RNA-konsentrasjon og integritet.Ved å bruke den innebygde algoritmen for å analysere profilen til RNA-prøven, kan Agilent-bioanalyzeren beregne en referanse-RNA-integritetsverdi, RNA Integrity Number (heretter referert til som RIN) [1].Jo større verdien av RIN er, desto høyere er integriteten til RNA (1 er ekstremt degradert, 10 er det mest komplette).Noen eksperimenter som involverer RNA foreslår å bruke RIN som en parameter for kvalitetsvurdering.Ved å ta sekvenseringseksperimenter med høy gjennomstrømning (heretter referert til som NGS) som et eksempel, antyder retningslinjene til Oncomine™ Human Immune Repertoire, som brukes til å påvise B-celle- og T-celleantigenreseptorer i Thermo Fishers Oncomine-panelserie, at prøver med RIN-verdier større enn 4, kan måles og klones mer effektivt (Finesgure).Det er forskjellige anbefalte områder for forskjellige paneler, og ofte kan en høyere RIN gi mer effektive data.

Figur 3, i Oncomine™ Human Immune Repertoire-eksperimenter, kan prøver med RIN større enn 4 oppdage mer effektive avlesninger og T-cellekloner.【2】

RIN-verdien har imidlertid også noen begrensninger.Selv om RIN har en høy korrelasjon med kvaliteten på NGS eksperimentelle data, er den ikke egnet for FFPE-prøver.FFPE-prøver har vært kjemisk behandlet i lang tid, og det ekstraherte RNA har generelt en relativt lav RIN-verdi.Dette betyr imidlertid ikke at de effektive dataene for eksperimentet må være utilfredsstillende.For nøyaktig å vurdere kvaliteten på FFPE-prøver, må vi bruke andre mål enn RIN.I tillegg til RIN kan Agilent bioanalyzer også beregne DV200-verdi som en evalueringsparameter for RNA-kvalitet.DV200 er en parameter som beregner andelen fragmenter større enn 200 bp i en RNA-prøve.DV200 er en bedre indikator på FFPE-prøvekvalitet enn RIN.For RNA ekstrahert av FFPE har det en veldig høy korrelasjon med antall gener som effektivt kan påvises og mangfoldet av gener [3].Selv om DV200 kan gjøre opp for manglene i kvalitetsdeteksjonen av FFPE, kan Agilent bioanalyzer fortsatt ikke analysere kvalitetsproblemene i RNA-prøver fullstendig, inkludert om det er hemmere i prøvene.Inhibitorer i seg selv kan påvirke amplifikasjonseffektiviteten til nedstrøms eksperimenter og redusere mengden nyttige data.For å vite om det er en inhibitor i prøven, kan vi ta i bruk den fluorescerende kvantitative PCR-metoden i sanntid som er beskrevet nedenfor.

04 sanntids fluorescerende kvantitativ PCR

Den fluorescerende kvantitative PCR-metoden i sanntid kan ikke bare oppdage inhibitorene i prøven, men gjenspeile også nøyaktig kvaliteten på RNA i FFPE-prøven.Sammenlignet med Agilent biologiske analysatorer er kvantitative fluorescensinstrumenter i sanntid mer populære i store biologiske laboratorier på grunn av deres bredere anvendelse.For å teste kvaliteten på RNA-prøver trenger vi kun å kjøpe eller klargjøre primerprober for interne referansegener, som GUSB (Kat.nr. Hs00939627).Ved å bruke dette settet med primere, prober og standarder (totalt RNA med kjent konsentrasjon) for å utføre absolutte kvantitative eksperimenter, kan den effektive RNA-fragmentkonsentrasjonen beregnes som evalueringsstandarden for RNA-kvalitet (Functional RNA Quantitation (FRQ) for kort).I en NGS-test fant vi at FRQ for RNA-prøver har en veldig høy korrelasjon med det effektive datavolumet.For alle prøver større enn 0,2 ng/uL FRQ, kan minst 70 % av avlesningene effektivt dekke referansesekvensen (figur 4).

Figur 4, FRQ-verdien detektert ved den kvantitative fluorescensmetoden har en veldig høy korrelasjon (R2>0,9) med de effektive dataene oppnådd i NGS-eksperimentet.Den røde linjen er FRQ-verdien lik 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

I tillegg til å være anvendelig for FFPE-prøver, kan den kvantitative PCR-metoden i sanntid også effektivt overvåke inhibitorer i prøver.Vi kan legge til prøven som skal detekteres inn i reaksjonssystemet med Internal Positive Control (IPC) og dens analyse, og deretter utføre fluorescenskvantifisering for å oppnå Ct-verdien.Hvis Ct-verdien henger etter Ct-verdien i reaksjonen uten prøve, indikerer det at inhibitoren er tilstede i prøven og hemmer amplifikasjonseffektiviteten i reaksjonen.

05 Qubit fluorescerende fargemetode

Qubit Fluorometer er den mest brukte lille enheten for deteksjon av nukleinsyrekonsentrasjon og renhet, som er enkel å betjene og finnes i nesten alle molekylærbiologiske laboratorier.Den beregner nøyaktig konsentrasjonen av nukleinsyre ved å detektere og nukleinsyrebindende fluorescerende fargestoff (Qubit deteksjonsreagens).Qubit har høy sensitivitet og spesifisitet, og kan nøyaktig kvantifisere RNA ned til pg/µL konsentrasjon.I tillegg til den velkjente evnen til nøyaktig å kvantifisere nukleinsyrekonsentrasjonen, kan Thermo Fishers siste nye modell, Qubit 4.0, også oppdage integriteten til RNA.Qubit 4.0s RNA-deteksjonssystem (RNA IQ Assay) oppdager integriteten til RNA ved samtidig å detektere to spesifikke fluorescerende fargestoffer.Disse to fluorescerende fargestoffene kan binde seg til henholdsvis store fragmenter og små fragmenter av RNA.Disse to fluorescerende fargestoffene indikerer andelen store fragmenter av RNA i prøven, og ut fra dette kan IQ-verdien (integritet og kvalitet) som representerer RNA-kvaliteten beregnes.IQ-verdien gjelder for både FFPE- og ikke-FFPE-prøver, og har stor innflytelse på den påfølgende sekvenseringskvaliteten.For å ta NGS-eksperimenter som et eksempel, i RNA-Seq-testeksperimentene utført på Ion torrent™-plattformen, hadde de fleste prøver med IQ-verdier større enn 4 minst 50 % effektive avlesninger (Figur 5).Sammenlignet med de ovennevnte deteksjonsmetodene er Qubit IQ Assay ikke bare mer praktisk å betjene og tar mindre tid (innen fem minutter), men har også en god korrelasjon mellom den målte parameteren IQ-verdi og datakvaliteten til nedstrømseksperimenter.

Figur 5 er det en stor korrelasjon mellom Qubit RNA IQ-verdien og de kartlagte avlesningene av RNA-Seq.【5】

Gjennom introduksjonen ovenfor tror jeg at alle har tilstrekkelig forståelse for ulike RNA kvalitetskontrollmetoder.I praksis kan du velgeden tilsvarende metoden i henhold til prøvetypen og eksisterende instrumenter.Bare ved å kontrollere kvaliteten på RNA godt kan vi unngå svikt i påfølgende eksperimenter forårsaket av dårlig prøvekvalitet, og dermed spare dyrebar tid, energi og kostnader.

Referanseprodukter:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

referanser

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: et RNA-integritetsnummer for å tilordne integritetsverdier til RNA-målinger.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Brukerveiledning for Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. Nr. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volum 3–7.https://doi.org/10.1093/toxsci/