Tradisjonelle revers transkriptaser kan ikke tolerere høye temperaturer (den optimale temperaturen for MMLV-aktivitet er 37-50°C, og AMV er 42-60°C).Det mer komplekse virale RNA kan ikke effektivt reverstranskriberes til cDNA ved lave temperaturer, noe som resulterer i deteksjonseffektivitet. Reduksjonen.Tradisjonell RT-qPCR krever generelt deltagelse av to nøkkelenzymer (revers transkriptase og DNA-polymerase), noe som gjør det umulig å forenkle driften av reaksjonssystemet og redusere kostnadene.Her vil vi introdusere to høytemperatur-resistente revers transkriptaser, TtH og RevTaq.Disse to enzymene har også funksjonen til DNA-polymerase, så de kalles bifunksjonelle enzymer.

TtH DNA-polymerase

Du må ha hørt om TtH, som er avledet fra den termofile bakterien Thermus thermophilus HB8.I nærvær av toverdige kationer som Mg2+, har den DNA-polymeraseaktivitet.Det er mye brukt i PCR-reaksjoner som Taq-enzym, men det har høyere varmebestandighet enn Taq-enzym, så det har også en bedre effekt på PCR med maler med høyt GC-innhold.

· Dette enzymet har i utgangspunktet ingen 3′→5′ eksonukleaseaktivitet og 5′→3′ eksonukleaseaktivitet, så det kan også brukes til dideoksy-sekvensering.

· Dette enzymet har RTase-aktivitet.I nærvær av Mn2+ vil RTase-aktiviteten økes.Ved å bruke denne funksjonen kan den brukes til å utføre revers transkripsjonsreaksjon og PCR-reaksjon i samme rør, det vil si ett-trinns RT-PCR.I nærvær av Mn2+ er imidlertid nøyaktigheten av RT-PCR ikke høy.RT-aktivitet har ingenting med rnaase H-aktivitet å gjøre.

· Den økte aktiviteten til Tth-DNA-polymerase (pH9, optimal +55℃～+70℃, maksimum +95℃) overvinner problemene forårsaket av RNA-sekundærstruktur.Det resulterende cDNA kan amplifiseres ved PCR med det samme enzymet i nærvær av Mg2+ ioner.

· Evnen til Tth-DNA-polymerase til å utføre revers transkripsjon og DNA-amplifikasjon ved høye temperaturer gjør dette enzymet nyttig for kvantitativ RT-PCR, kloning og genekspresjonsanalyse av cellulært og viralt RNA.
· Tth-DNA-polymerase brukes til RT-PCR for å amplifisere RNA opp til 1kb.

Egenskaper og fordeler

Tth DNA-polymerase:

• Sikre den optimaliserte polymerasekjedereaksjonen (PCR) produktstørrelsen, minst 1000 bp i RT-PCR-reaksjonen

• Godta modifisert deoksyribonukleosidtrifosfat som et substrat

• Ikke relatert til RNase H-aktivitet

• Har høy termisk stabilitet for å overvinne problemer, vanligvis relatert til den høye sekundære strukturen tilstede i RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polymerase

En varmebestandig DNA-polymerase med revers transkriptaseaktivitet

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymerase er et konstruert, svært varmebestandig, dobbeltfunksjonelt enzym med revers transkriptase og DNA-polymeraseaktiviteter oppnådd gjennom rettet og kunstig evolusjon.

· Halveringstiden til RevTaq RT-PCR DNA-polymerase ved 95°C er mer enn 40 minutter.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase tillater høytemperatur revers transkripsjon direkte fra RNA-malen, og revers transkripsjonstrinnet kan gjentas flere ganger for å generere flere cDNA-maler.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase tillater "null-trinns" RT-PCR (ingen isotermisk revers transkripsjonstrinn), fordi i det sykliske PCR-forlengelsestrinnet skjer revers transkripsjon og DNA-amplifikasjon samtidig.Dette fremmer også den omvendte transkripsjonsreaksjonen ved høye temperaturer, og minimerer dermed problemene som oppstår ved å smelte den sterke sekundære strukturen i RNA ved høye temperaturer.

· På grunn av den aptamerbaserte varmstartformelen vil RevTaq RT-PCR DNA-polymerase gi bedre resultater når annealings- og ekstensjonstemperaturen er høyere enn 57°C.

· Siden enzymet er varmebestandig, anbefales det å designe primere og prober med svært høye smeltepunkter (>60°C).

· Det anbefales å optimalisere temperaturen på glødings-/forlengelsestrinnet gjennom en temperaturgradient under reaksjonsoppsettprosessen.

· Jo høyere temperatur, jo høyere spesifisitet til PCR.Den omvendte transkripsjonssyklusen utføres vanligvis ved en høyere temperatur enn PCR-syklusen, fordi DNA Primer:RNA Template-hybridisering vanligvis har et høyere smeltepunkt enn DNA Primer:cDNA Template-dupleks.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase er genetisk konstruert og optimert, og amplikonstørrelsen er mellom 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polymerase deteksjonsgrense når 4 kopier/

Det optimerte reaksjonssystemet (etablering av primere med høyt smeltepunkt) er vist i figuren.RevTaq RT-PCR DNA-polymerase-drevet RT-PCR viser bedre sensitivitet enn TaqPath 1-trinns RT-qPCR mastermix, og lavere deteksjon Prøvefortynningsgradient.

Flere fordeler:

Hurtigstartfunksjon → Det første termiske denatureringstrinnet kan hoppes over.

Hot-start aptamer formel → Gi 100 % enzymaktivitet umiddelbart og hindre uspesifikk amplifikasjon ved lave temperaturer (<57°C).

Spaltningsfunksjon → RNA-ekstraksjonstrinnet er utelatt, fordi RevTaq RT-PCR DNA-polymerase også kan behandle rå reaksjonsprøver.Det kan umiddelbart ødelegge cellemembranene til eukaryoter, bakterier og virus i en varm RT-PCR-syklus.

IVD råvarenivå → høye kvalitetsstandarder og ekstremt konkurransedyktige priser