Nylig oppdaget jeg noe fantastisk!Mange avanserte eksperimentelle fagfolk rundt ham kjenner ikke engang noen veldig grunnleggende eksperimentelle kunnskapspunkter.

Kan du for eksempel svare på følgende spørsmål?

Er det forskjell på OD260 og A260?Hva betyr hver?
OD er ​​forkortelsen for optisk tetthet (optisk densitet), A er forkortelsen for absorbans (absorbans), de to konseptene er faktisk de samme, "optisk tetthet" er "absorbans", men "optisk tetthet" er i tråd med de fleste nasjonale standarder og mer standardisert.

Vanligvis måler vi OD-verdien ved 260nm for å beregne nukleinsyrekonsentrasjonen, så hva representerer 1OD?
Nukleinsyre har en maksimal absorpsjonstopp ved en bølgelengde på 260nm, som inneholder både DNA og RNA, samt fragmenterte nukleinsyrefragmenter (dette er nøkkelpunktet).
OD-verdien målt ved en bølgelengde på 260 nm ble registrert som OD260.Hvis prøven er ren, kan OD260-verdien beregne konsentrasjonen av nukleinsyreprøven.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (dobbeltstrenget DNA)
=37 μg/ml ssDNA (enkeltrådet DNA)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTP-er (oligonukleotider)
Er det noen sammenheng og forskjell mellom RT-PCR, Realtime-PCR og QPCR?
RT-PCR er forkortelse for Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, forkortelse for Quantitative Real Time PCR
Selv om Real Time PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) og Reverse Transcription PCR (revers transkripsjon PCR) begge ser ut til å være forkortet til RT-PCR.Men den internasjonale konvensjonen er: RT-PCR refererer spesifikt til revers transkripsjons-PCR.

Hva er de vanligste nt, bp og kb for å beskrive lengden på DNA/RNA i biologi?
nt = nukleotid
bp = basepar basepar
kb = kilobase

Selvfølgelig vil du si at mange ikke bryr seg om disse små detaljene!Alle gjør dette, og ingen vil spørre deg hva det er.Du vet at dette er unødvendig, ikke sant?

Nei, nei, nei, det er veldig nødvendig å vite dette!på grunn av hvilken?
Fordi du vil legge ut en artikkel!Bror!Enten du sikter mot eksamen eller forfølger vitenskapelige forskningsprestasjoner, må du stole på artikler for å snakke!

Nukleinsyreekstraksjon bør være det enkleste og mest grunnleggende eksperimentet.Kvaliteten på nukleinsyreekstraksjon bestemmer direkte resultatene av påfølgende eksperimenter.

Selv om jeg har sagt det mange ganger, er det fortsatt mange venner som ikke bryr seg.Denne gangen bestemte jeg meg for å flytte ut av artikkelen!

Minimumsinformasjon for publisering av kvantitative sanntids PCR-eksperimenter, referert til som MIQE, er et sett med retningslinjer for kvantitative fluorescenseksperimenter lansert internasjonalt, som foreslår minimumsstandarder for den eksperimentelle informasjonen som er nødvendig for evaluering av fluorescens kvantitative PCR-eksperimenter og publisering av artikler.Gjennom de eksperimentelle betingelsene og analysemetodene gitt av eksperimentator, kan anmelderne bedre vurdere gyldigheten av forskerens eksperimentelle opplegg.

Det kan sees at i seksjonen av nukleinsyreekstraksjon har følgende deteksjonselementer blitt foreslått,

"E" angir informasjon som må gis og "D" angir informasjon som bør gis om nødvendig.

Formen er veldig komplisert, faktisk vil jeg si at alle må starte fra

renhet (D), utbytte (D), integritet (E) og konsistens (E) for å evaluere nukleinsyrer i disse fire aspektene.

I henhold til eksperimentelle vaner, snakk først om evalueringsmetodene for renhet og konsentrasjon.

OD-måling er favoritten og enkleste deteksjonsmetoden for eksperimenter.Når det gjelder prinsippet, vil jeg ikke gå inn på detaljer her.Mange laboratorier bruker nå ultramikrospektrofotometre for å direkte kvantitativt analysere nukleinsyreprøver.Mens absorbansverdien vises, gir programmet direkte konsentrasjonsverdien (nukleinsyre, protein og fluorescerende fargestoff) og relaterte forhold.Når det gjelder analysen av OD-verdien, lagre dette bildet, så går det bra.

Universal OD verdi løsningsliste

Det er imidlertid noen få forbehold som må tas frem separat for deg.

(Tross alt vet jeg at du må være de som sparer og venter til du trenger dem!)

Merknad 1 Utstyr

OD-verdien vil bli påvirket av forskjellig utstyr.Så lenge OD260 er innenfor et visst område, er verdiene til OD230 og OD280 meningsfulle.For eksempel er absorbansområdet til den vanlige Eppendorf D30 ved 260nm 0~3A, og NanoDrop One fra Thermo er på 260nm.Absorbansområdet på 0,5~62,5A.

Notat 2Fortynningsreagens

OD-verdien kan påvirkes av fortynning av forskjellige reagenser.For eksempel OD260/280-avlesningen av renset RNA i pH7,5 10 mM Trisbuffer er mellom 1,9-2,1, mens inøytral vandig løsningforholdet vil være lavere, kanskje bare 1,8-2,0, men dette betyr ikke at kvaliteten på RNA endrer Difference.

Merknad 3Reststoffer

Eksistensen av reststoffer vil påvirke nøyaktigheten av nukleinsyrekonsentrasjonsmålinger, så det er nødvendig å unngå protein-, fenol-, polysakkarid- og polyfenolrester i nukleinsyreprøver så mye som mulig.

Men faktisk er ekstraksjon med organiske reagenser en gammel metode.I kommersielle sett kan ekstraksjonseffekten oppnås gjennom en silikabasert adsorpsjonskolonne kombinert med sentrifugering, unngår giftige og skadelige organiske reagenser som er vanskelige å fjerne osv. Problemet, som f.eks.Foregenes nukleinsyreekstraksjonssett, bruker ikke DNase/RNase og giftige organiske reagenser gjennom hele operasjonen, raskt og trygt, ogeffekten erflink(sa tilfeldigvis at den var skallet, men jeg vet at du vil vite det).

Eksempel 1: Genomisk DNA-ekstraksjonsutbytte og renhet

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) behandler jordprøver fra forskjellige kilder, og mengden og renheten av genomisk DNA som er oppnådd er vist i følgende tabell:
Eksempel 2: Vevs-RNA-ekstraksjonsutbytte og renhet

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) behandlet forskjellige vevsprøver, og mengden og renheten av oppnådd RNA er vist i tabellen nedenfor (for musevev):
Men ikke tro at du er ferdig med OD-verdien.Har du noen ta vare på nøkkelpunktene jeg tegnet for deg foran?

Legge merke til

Fragmenterte nukleinsyremolekyler vil også bli beregnet i absorbansen.Forutsatt at du har genomiske DNA-rester i RNA, vil OD-verdien din se ut til å være veldig høy, men den faktiske konsentrasjonen av RNA kan ikke bestemmes.Hvorvidt ditt RNA er Det er ikke klart om det er nedbrytning, så vi trenger fortsatt en omfattende evalueringsmetode for å gi en mer nøyaktig vurdering, det vil si nukleinsyreintegritetsevalueringen nevnt i MIQE.