PCR, flere PCR, In situ PCR, Omvendt PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Vi vil sortere ut konsepter, trinn og detaljer for ulike PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, referert til som PCR, er en molekylærbiologisk teknologi som brukes til å forstørre spesifikke DNA-fragmenter.Det kan betraktes som en spesiell DNA-replikasjon in vitro.DNA-polymerase (DNA Polymerase I) ble oppdaget så tidlig som i 1955, og Klenow Fragment of E. Coli, som har eksperimentell verdi og praktisk funksjon, ble oppdaget av Dr. H. Klenow på begynnelsen av 1970-tallet, men fordi dette enzymet ikke tåler temperatur, kan høy temperatur degenerere det, så det møter ikke polymerase-degenerasjonskjedereaksjonen.Enzymene som er i bruk i dag (kalt Taq polymerase), ble isolert fra Thermus aquaticus, en varmekildebakterie i 1976. Dens karakteristikk er at den tåler høy temperatur og er et ideelt enzym, men det er mye brukt etter 1980-tallet.Det opprinnelige konseptet av den opprinnelige primitive prototypen av PCR ligner på genreparasjon og -kopiering, som ble foreslått av Dr. KJell Kleppe i 1971. Han publiserte den første enkle og kortsiktige genkopien (ligner på de to første syklusreaksjonene av PCR).PCR utviklet i dag ble utviklet av Dr. Kary B. Mullis i 1983. Dr. Mullis tjente PE-selskaper det året, så PE har en spesiell status i PCR-industrien.Dr. Mullis publiserte offisielt den første relaterte artikkelen med Saiki og andre i 1985. Siden den gang har bruken av PCR vært tusenvis av miles om dagen, og kvaliteten på relaterte artikler kan sies å gjøre mange andre forskningsmetoder usmakelige.Deretter er PCR-teknologi mye brukt i biologisk vitenskapelig forskning og kliniske applikasjoner, og blir den viktigste teknologien for molekylærbiologisk forskning.Mullis vant også Nobelprisen i kjemi i 1993.

PCRPrinsipp

Grunnprinsippet for PCR-teknologi ligner på den naturlige replikasjonsprosessen til DNA, og spesifisiteten avhenger av oligonukleotidprimeren som er komplementær til begge ender av målsekvensen.PCR er sammensatt av degenerasjons-annealing-utvidende tre grunnleggende reaksjonstrinn: ①Degenerering av mal-DNA: Etter at mal-DNA er oppvarmet til ca. 93°C i en viss tidsperiode, vil den doble DNA-løsningen for det dobbeltkjedede DNA som dannes ved PCR-amplifiseringen av mal-DNA-et som forlater, gjøre det til en enkeltkjede med primer-reaksjonen slik at den kan kombineres for neste primer-reaksjon.②Glødingen (forbindelsen) av template-DNA og primeren: Etter at template-DNA er oppvarmet og degenerert til en enkelt kjede, synker temperaturen til ca. 55°C.Den komplementære sekvensen til primeren og mal-DNA enkeltkjede.③Forlengelsen av primeren: DNA-template - primerbindingen er basert på virkningen av TaqDNA-polymerase, med dNTP som reaksjonsråmateriale.Behold replikasjonsprinsippet, syntetiser en ny semi-reservert kopikjede som komplementerer mal-DNA-kjeden, og gjenta syklusdegenerasjon-annealing-forlengelse tre prosesser kan få mer "semi-reservert kopikjede", og denne nye kjeden er tilgjengelig igjen. Bli en mal for neste syklus.Det tar 2-4min å fullføre loopen, målgenet kan amplifiseres flere millioner ganger på 2-3 timer.

StandardPCRReaksjonssystem

Fem elementer av PCR-reaksjon

Det er hovedsakelig fem typer stoffer involvert i PCR-reaksjonen, nemlig primer, enzym, dNTP, template og buffer (Mg2+ er nødvendig).[PCR-prosedyre]

Standard PCR-prosessen er delt inn i tre trinn

1. DNA-degenerasjon (90°C-96°C): Dobbeltkjedede DNA-maler under termisk virkning, hydrogenbindinger brytes og danner et enkeltkjedet DNA.

2. Gløding (25℃ -65℃): Systemtemperaturen reduseres, primeren kombineres med DNA-malen for å danne en lokal dobbelkjede.

3. Forlengelse (70℃ -75℃): Under påvirkning av Taq-enzymet (ca. 72°C, den beste aktiviteten), brukes dNTP som råmateriale, strekker seg fra 5′-enden av primeren → 3′-enden, syntese og mal komplementerer hverandres DNA-kjede.

Hver syklus denatureres, utglødes og utvides, noe som dobler DNA-innholdet.For tiden, på grunn av det korte amplifikasjonsområdet, kan noe PCR replikeres på svært kort tid selv om Taq-enzymaktiviteten ikke er optimal, så den kan endres til to trinn, det vil si at annealingen og forlengelsen kan utføres ved 60°C-65°C samtidig.For å redusere prosessen med å løfte og kjøle og forbedre responshastigheten.

PCR-reaksjonsfunksjoner

● Høy spesifisitet

De spesifikke avgjørende faktorene for PCR-responsen er: ①Den spesifikke kombinasjonen av primeren og templat-DNA.② Prinsippet om baseparing.③Lojaliteten til TaqDNA-polymerasesyntesereaksjonen.④Spesifisiteten og konservativiteten til målgenet.

Den riktige kombinasjonen av primere og maler er nøkkelen.Bindingen av primeren og malen og forlengelsen av primerkjeden er basert på prinsippet om alkalisk basetilpasning.Lojaliteten til polymerasesyntesereaksjoner og høytemperaturmotstanden til Taq DNA-polymerasen for å lage bindingen (forbindelsen) av malen og primeren i reaksjonen kan utføres ved høyere temperatur.Spesifisiteten til kombinasjonen er sterkt økt.Klippet kan opprettholde en høy grad av korrekthet.Ved å velge en genetisk målregion med høy konservativitet og høy konservativitet, er dens spesifisitet høyere.

● Høy følsomhet

Produksjonsvolumet av PCR-produkter økes med indeks, noe som kan utvide startmalen til Picker (PG=10-12) for å øke nivået av mikrokontroller til nivået av mikrogram (μg= -6).En målcelle kan påvises fra 1 million celler;ved påvisning av virus kan følsomheten til PCR nå 3 RFUer (tomme flekker dannet enheter);minste deteksjonsrate i bakterievitenskap er 3 bakterier.

● Enkel og rask

PCR-refleksjonen bruker en høytemperatur Taq DNA-polymerase, som tilsetter reaksjonsløsningen på en gang, det vil si en degenerasjons-anneal-forlengelsesreaksjon på DNA-amplifikasjonsløsningen og vannbadekaret.Vanligvis er amplifikasjonsreaksjonen fullført i løpet av 2 til 4 timer.Forsterkede produkter analyseres vanligvis med elektrisk sverd, og trenger ikke å bruke isotoper, ingen radioaktiv forurensning og enkel markedsføring.

● Renheten til prøven er lav

Det er ikke nødvendig å skille virus eller bakterier og kulturceller.DNA-råprodukter og RNA kan brukes som forsterkere.DNA-amplifikasjonsdeteksjon kan brukes direkte ved bruk av kliniske prøver som blod, kroppsvæske, hostevæske, hår, celler og levende vev.

PCRvanlige problemer

● Falsk negativ, ingen forsterkede bånd

De viktigste stadiene i PCR-reaksjonen inkluderer: ① forberedelse av templatnukleinsyrer, ② kvalitet og spesifisitet til primere, ③ kvaliteten på enzymer ④ PCR-syklusforhold.Å finne årsaken bør også analyseres og studeres for koblingene ovenfor.

Maler: ① Malen inneholder diverse proteiner, ② Malen inneholder en Taq-enzymhemmer, ③ Proteinet i malen er ikke eliminert, spesielt gruppeproteinet i kromosomet.⑤ Deminer-nukleinsyredegenerering er ikke grundig.Når kvaliteten på enzymer og primere er god, er det ikke noe amplifikasjonsbånd, som mest sannsynlig er fordøyelsesbehandlingen av prøver.Det er noe galt med malnukleinsyreekstraksjonsprosessen, så for å forberede en effektiv og stabil fordøyelsesløsning, bør prosedyren fikses og ikke endres vilkårlig.

Enzyminaktivering: et nytt enzym eller både gamle og nye enzymer bør brukes sammen for å analysere om enzymaktiviteten er tapt eller utilstrekkelig, noe som fører til falske negativer.Det skal bemerkes at Taq-enzym eller etidiumbromid noen ganger glemmes.

Primer: kvaliteten på primeren, konsentrasjonen av primeren, og om konsentrasjonen av de to primerne er symmetrisk.Det er en vanlig årsak til PCR-svikten, eller det økende båndet er ikke ideelt og utsatt for diffusjon.Det er problemer med kvaliteten på primerne til enkelte batchnumre.De to primerne har en høy konsentrasjon og en lav konsentrasjon, noe som forårsaker laveffektiv asymmetrisk amplifikasjon.Mottiltakene er: ① Velg en god primer for å syntetisere enheter.② Konsentrasjonen av primeren avhenger ikke bare av OD-verdien, men tar også hensyn til primerens opprinnelige væske for å lage agar-sukkergelelektroforese.Det må være en primerstrimmelsone, og lysstyrken til de to primerne skal være generelt konsistent.Belte, PCR kan mislykkes på dette tidspunktet, og det bør løses med primersynteseenheten.Hvis en primer er høy, er lysstyrken lav, og konsentrasjonen må balanseres når den fortynnes.③ Primeren bør betales og oppbevares i høy konsentrasjon for å forhindre flere frysing eller langvarige nedkjølingsdeler av kjøleskapet, noe som vil føre til at primeren forringes og brytes ned.④ Utformingen av primeren er urimelig, for eksempel lengden på primeren er utilstrekkelig, og diclusteren dannes mellom primerne.

Mg2+konsentrasjon: Mg2+ionekonsentrasjon har stor innvirkning på PCR-amplifikasjonseffektiviteten.For høy konsentrasjon kan redusere det motsatte kjønn av PCR-amplifikasjon.Hvis konsentrasjonen er for lav, vil PCR-forsterkningsutgangen til og med gjøre PCR-forsterkningsfeil uten ekspansjonsbåndet.

Endring av reaksjonsvolum: Volumet som brukes i PCR-amplifisering er 20 ul, 30 ul og 50 ul eller 100 ul, det store volumet av søknaden om PCR-amplifisering er satt i henhold til ulike formål med vitenskapelig forskning og klinisk testing.Etter å ha laget små volumer som 20ul, er det nødvendig å lage en ledningstilstand når du lager størrelsen, ellers vil den mislykkes.

Fysiske årsaker: Transformasjon er svært viktig for PCR-amplifikasjon.Hvis degenerasjonstemperaturen er lav, er degenerasjonstiden kort, det vil sannsynligvis forekomme i falske negativer;for lav glødetemperatur kan forårsake uspesifikk amplifikasjon og redusere spesifikk amplifikasjonseffektivitet.Påvirker i høy grad kombinasjonen av primere og maler for å redusere PCR-amplifikasjonseffektiviteten.Noen ganger er det nødvendig å bruke standard termometre for å oppdage variabiliteten, glødingen og utvidet temperatur i forlengelsen eller vannløselig komfyr, som er en av årsakene til feilen i PCR.

Målsekvensvarianter: Hvis målsekvensen oppstår, en mutasjon eller delesjon, kombinasjonen av prototypen og malen kombineres, eller på grunn av mangel på målsekvens, vil primeren og malen miste den komplementære sekvensen, og PCR-amplifiseringen vil ikke være vellykket.

● Falsk positiv

PCR-amplifikasjonsbåndet ser ut til å være i samsvar med målsekvensbåndet, og noen ganger er båndet mer ryddig og høyere.

Primerdesign er ikke hensiktsmessig: den valgte amplifikasjonssekvensen og ikke-hensiktsmessige amplifikasjonssekvensen er homologe, så når PCR-amplifisering er de amplifiserte PCR-produktene ikke-hensiktsmessige sekvenser.Målsekvensen er for kort eller primeren er for kort, og den er utsatt for falsk positiv.Må redesignes.

Kryssforurensning av målsekvens eller amplifikasjonsprodukter: Det er to årsaker til denne forurensningen: For det første kryssforurensning av hele genomet eller store segmenter, som fører til falske positiver.Denne typen falsk positiv kan løses ved hjelp av følgende metoder: Vær forsiktig og skånsom under drift for å forhindre at målsekvensen inhaleres inn i prøvepistolen eller spruter ut av sentrifugalrøret.Med unntak av enzymer og stoffer som ikke tåler høye temperaturer, bør alle reagenser eller utstyr desinfiseres med høyt trykk.Sentrifugalrørene og prøvene bør brukes på en gang.Når det er nødvendig, før tilsetning av prøver, eksponeres reaksjonsrøret og reagenset for ultrafiolette stråler for å ødelegge den eksisterende nukleinsyren.For det andre, små fragmenter i luftforurensningen.Disse små fragmentene er kortere enn målsekvensen, men de har en viss homologi.De kan skjøtes med hverandre.Etter komplettering av primerne kan PCR-produktet utvides, noe som vil forårsake falsk positiv produksjon.Den kan brukes til å redusere eller eliminere nest PCR-metoden.

● Vises uspesifikke amplifikasjonsbånd

Båndene som dukket opp etter PCR-amplifisering er inkonsistente med forventet størrelse, eller store eller små, eller samtidig, eller samtidig, spesifikke amplifikasjonsbånd og ikke-spesifikke amplifikasjonsbånd.Fremveksten av ikke-spesifikke bånd er: For det første er primerne ufullstendige komplementære til målsekvensen, eller polymeriseringen av primeren for å danne en dicluster.Den andre er at konsentrasjonen av MG2+ioner er for høy, utglødningstemperaturen er for lav, og antallet PCR-sykluser er relatert.For det andre kvaliteten og mengden av enzymer.Ofte er enzymer fra noen kilder utsatt for ikke-spesielle bånd, og enzymene fra den andre kilden forekommer ikke.Noen ganger forekommer også uspesifikk amplifikasjon av enzymer.Mottiltakene er: re-designet attraktive om nødvendig.Reduser mengden enzym eller bytt ut enzymet fra en annen kilde.Reduser mengden primære, øk mengden maler på passende måte, og reduser antall sykluser.Øk utglødningstemperaturen på riktig måte eller bruk metoden med to temperaturpunkter (93°C degenerering, utglødning og forlengelse ved ca. 65°C).

● Vise flassende slepe eller smøretape

PCR-amplifikasjon ser noen ganger ut til å være påført eller avskallet eller teppelignende belte.Av grunnen, på grunn av overdreven mengde enzymer eller dårlig kvalitet på enzymet, er dNTP-konsentrasjonen for høy, Mg2+-konsentrasjonen er for høy, annealingstemperaturen er for lav og antall sykluser er for mye.Mottiltakene er: ①Reduser mengden enzymer, eller endre enzymet fra en annen kilde.②Reduser konsentrasjonen av dNTP ③Reduser Mg2+-konsentrasjonen riktig.④Øk antallet maler og reduser antall sykluser.

Relaterte produkter

PCR Heroᵀᴹ (med fargestoff)

◮ Høyere troskap: 6 ganger høyere kvalitet enn vanlig Taq-enzym;

◮ Raskere forsterkningshastighet

◮ Mer maltilpasning

◮ Høyere forsterkningseffektivitet

◮ Miljøtoleransen er sterkere: plassert ved 37°C i en uke, opprettholder mer enn 90 % aktivitet;

◮ Den har 5'→3' DNA-polymeraseaktivitet og 5'→3' eksonukleaseaktivitet, uten 3'→5' eksonukleaseaktivitet.

PCR Easyᵀᴹ (med fargestoff)

Det unike reaksjonssystemet og høyeffektive Taq DNA-polymerase gjør at PCR-reaksjonen har høyere amplifikasjonseffektivitet, spesifisitet og sensitivitet.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Grønn I

◮ Ett-trinns kit gjør omvendt transkripsjon og qPCR to reaksjoner i samme rør, trenger bare å legge til mal-RNA, spesifikke PCR-primere og RNase-fri ddH₂O.

◮ Settet kan raskt og effektivt kvantitativt analysere viralt RNA eller spore RNA.

◮ Settet bruker et unikt Foregene revers transkripsjonsreagens og Foregene HotStar Taq DNA-polymerase kombinert med et unikt reaksjonssystem for å effektivt forbedre amplifikasjonseffektiviteten og spesifisiteten til reaksjonen.

◮ Det optimaliserte reaksjonssystemet gjør at reaksjonen har høyere deteksjonsfølsomhet, sterkere termisk stabilitet og bedre toleranse.

◮ RT-qPCR Enkel^TM(One Step)-SYBR Green I-settet leveres med ROX intern referansefarge, som kan brukes til å eliminere signalbakgrunn og signalfeil mellom brønner, noe som er praktisk for kunder å bruke i forskjellige modeller av kvantitative PCR-instrumenter.

RT enkelt^TMII (Master Premix for første-streng cDNA syntese forsanntids PCR)

-Effektiv evne til å fjerne gDNA, som kan fjerne gDNA i malen innen 2 minutter.

-Effektivt omvendt transkripsjonssystem, det tar bare 15 minutter å fullføre syntesen av den første strengen cDNA.

-Komplekse maler: maler med høyt GC-innhold og kompleks sekundærstruktur kan også reverseres med høy effektivitet.

-Høysensitivt omvendt transkripsjonssystem, pg-nivå maler kan også få høykvalitets cDNA.

-Revers transkripsjonssystemet har høy termisk stabilitet, den optimale reaksjonstemperaturen er 42 ℃, og det har fortsatt god revers transkripsjonsytelse ved 50 ℃.