PCR er den mest brukte nukleinsyreamplifikasjonsteknologien og er mye brukt på grunn av dens sensitivitet og spesifisitet.Imidlertid krever PCR gjentatt termisk denaturering og kan ikke bli kvitt begrensningene ved å stole på instrumenter og utstyr, noe som begrenser bruken i klinisk felttesting.

Siden tidlig på 1990-tallet har mange laboratorier begynt å utvikle konstant temperaturforsterkningsteknologi som ikke krever termisk denaturering.Nå har de utviklet loop-mediert isotermisk amplifikasjonsteknologi, isotermisk amplifikasjonsteknologi for tråderstatning, isoterm amplifikasjonsteknologi med rullende sirkel og nukleinsyresekvensavhengighet.Isotermisk forsterkningsteknologi og andre teknologier. 

Loop-mediert isoterm forsterkning

Amplifikasjonsprinsippet er basert på det faktum at DNA er i en dynamisk likevektstilstand ved ca. 65°C.Når en hvilken som helst primer er baseparet og utvidet til den komplementære delen av dobbelttrådet DNA, vil den andre tråden dissosiere og bli enkelttrådet.

Ved denne temperaturen bruker DNA 4 spesifikke primere for å stole på en trådforskyvnings-DNA-polymerase for å få syntesen av trådforskyvnings-DNA til å selvsirkulere kontinuerlig.

Bestem først de 6 spesifikke regionene F3, F2, F1, B1, B2, B3 på målgenet, og design deretter 4 primere basert på disse 6 spesifikke regionene (som vist i figuren nedenfor):

Den fremre indre primeren (FIP) er sammensatt av F1c og F2.

Bakover inner primeren (BIP) er sammensatt av B1c og B2, og TTTT brukes som spacer i midten.

De ytre primerne F3 og B3 er henholdsvis sammensatt av F3- og B3-regioner på målgenet.

I LAMP-reaksjonssystemet er konsentrasjonen av den indre primeren flere ganger den til den ytre primeren.Den indre primeren kombineres først med maltråden for å syntetisere en komplementær tråd for å danne en DNA-dobbeltråd.Deretter kombineres den ytre primeren med malstrengen for å danne en DNA-dobbeltråd.Under påvirkning av BstDNA-polymerase frigjøres den komplementære tråden syntetisert av den indre primeren.Etter en rekke reaksjoner danner den komplementære strengen til slutt en enkelt DNA-streng med en manualstruktur.

Hantelstrukturen DNA-enkeltstrengen i seg selv brukes som en mal for kontinuerlig å danne et overgangsstamme-løkkestruktur-DNA med en åpen ende.De indre og ytre primerne styrer overgangsstammen-løkkestruktur-DNAet til kontinuerlig å gjennomgå trådforskyvnings- og forlengelsesreaksjoner, og til slutt danner flere stammeløkkestrukturer med forskjellige lengder.DNA-blanding.

Fordeler og ulemper med loop-mediert isoterm forsterkning

Fordeler med LAMP:

(1) Høy amplifikasjonseffektivitet, som effektivt kan amplifisere 1-10 kopier av målgenet innen 1 time, og amplifikasjonseffektiviteten er 10-100 ganger den for vanlig PCR.

(2) Reaksjonstiden er kort, spesifisiteten er sterk, og det kreves ikke noe spesielt utstyr.

Mangler ved LAMP:

(1) Kravene til primere er spesielt høye.

(2) Det amplifiserte produktet kan ikke brukes til kloning og sekvensering, men kan kun brukes til vurdering.

(3) På grunn av sin sterke følsomhet er det lett å danne aerosoler, noe som forårsaker falske positiver og påvirker testresultatene.

Sfortrengningsforsterkning

Strand displacement amplification (SDA) er en in vitro isotermisk DNA-amplifikasjonsteknikk basert på enzymatisk reaksjon først foreslått av den amerikanske forskeren Walker i 1992.

Det grunnleggende systemet til SDA inkluderer en restriksjonsendonuklease, en DNA-polymerase med trådforskyvningsaktivitet, to par primere, dNTP-er og kalsium- og magnesiumioner og buffersystemer.

Prinsippet for trådforskyvningsamplifikasjon er basert på den kjemisk modifiserte restriksjonsendonukleasegjenkjenningssekvensen i begge ender av mål-DNA.Endonukleasen åpner gapet i tråd-DNA på gjenkjenningsstedet, og DNA-polymerasen utvider gapet 3′ End og erstatter neste DNA-tråd.

De erstattede enkelttrådene av DNA kan kombineres med primere og utvides til dobbelttråder med DNA-polymerase.Denne prosessen gjentas kontinuerlig, slik at målsekvensen effektivt amplifiseres.

Fordeler og ulemper med strengforskyvningsteknologi

Fordeler med SDA:

Amplifikasjonseffektiviteten er høy, reaksjonstiden er kort, spesifisiteten er sterk, og det kreves ikke noe spesielt utstyr.

Mangler ved SDA:

Produktene er ikke ensartede, og noen enkelt- og dobbelttrådede produkter produseres alltid i SDA-syklusen, og tailing vil uunngåelig oppstå når de oppdages ved elektroforese.

Rolling sirkel forsterkning

Rolling circle amplification (RCA) er foreslått ved å trekke på metoden for å kopiere DNA fra patogene organismer ved å rulle sirkel.Det refererer til bruken av enkelttrådet sirkulært DNA som mal ved konstant temperatur, og en spesiell DNA-polymerase (som Phi29) ) Under påvirkning av rullende sirkel-DNA-syntese for å oppnå amplifisering av målgenet.

RCA kan deles inn i lineær forsterkning og eksponentiell forsterkning.Effektiviteten til lineær RCA kan nå 10⁵ganger, og effektiviteten til eksponentiell RCA kan nå 10⁹ganger.

Enkelt skille, som vist i figuren nedenfor, bruker lineær amplifikasjon a kun 1 primer, eksponentiell amplifikasjon b har 2 primere.

Lineær RCA kalles også single primer RCA.En primer binder seg til sirkulært DNA og utvides ved virkningen av DNA-polymerase.Produktet er en lineær enkeltstreng med et stort antall repeterende sekvenser tusenvis av ganger lengden til en enkelt sløyfe.

Siden produktet av lineær RCA alltid er koblet til startprimeren, er den enkle fikseringen av signalet en stor fordel.

Eksponentiell RCA, også kjent som Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), i eksponentiell RCA, en primer forsterker RCA-produktet, den andre primeren hybridiserer med RCA-produktet og utvider seg, og erstatningen er allerede bundet til RCA-produktet. Nedstrøms-primerne forlenger strengen, og gjentar forlengelse og erstatning for å produsere et dendritisk produkt.

Fordelene og ulempene med nukleinsyreamplifikasjon med rullende sirkel

Fordeler med RCA:

Høy sensitivitet, god spesifisitet og enkel betjening.

Mangler ved RCA:

Bakgrunnsproblemer under signaldeteksjon.Under RCA-reaksjonen kan den usirkulerte hengelåsproben og mal-DNA eller RNA til den ubundne proben generere noen bakgrunnssignaler. 

Nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon

Nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon (NASBA) er en ny teknologi utviklet på grunnlag av PCR.Det er en kontinuerlig og isotermisk nukleinsyreamplifikasjon ledet av et par primere med en T7-promotersekvens.Teknologien kan forsterke templat-RNA-et med omtrent 109 ganger på omtrent 2 timer, som er 1000 ganger høyere enn den konvensjonelle PCR-metoden og krever ikke spesialutstyr.

Denne teknologien har blitt brukt for rask diagnostisering av sykdommer så snart den dukket opp, og mange selskaper bruker for tiden denne metoden i RNA-deteksjonssett.

Selv om RNA-amplifisering også kan bruke PCR-teknologi for revers transkripsjon, har NASBA sine egne fordeler: den kan utføres under relativt konstante temperaturforhold, og den er mer stabil og nøyaktig enn tradisjonell PCR-teknologi.

Reaksjonen er ved 41 grader Celsius og krever AMV (avian myeloblastosis virus) revers transkriptase, RNase H, T7 RNA polymerase og et par primere for å fullføre.

Prosessen inkluderer hovedsakelig:

Foroverprimeren inneholder den komplementære sekvensen til T7-promotoren.Under reaksjonen binder den fremre primeren seg til RNA-tråden og katalyseres av AMV-enzymet for å danne en DNA-RNA-dobbeltråd.

RNase H fordøyer RNA i hybriddobbeltråden og beholder det enkelttrådede DNA.

Under påvirkning av den reverse primeren og AMV-enzymet dannes en DNA-dobbeltstreng som inneholder T7-promotersekvensen.

Under påvirkning av T7 RNA-polymerase fullføres transkripsjonsprosessen og en stor mengde mål-RNA produseres.

Fordeler med NASBA:

(1) Primeren har en T7-promotersekvens, men det fremmede dobbelttrådete DNAet har ingen T7-promotersekvens og kan ikke amplifiseres, så denne teknologien har høy spesifisitet og sensitivitet.

(2) NASBA inkorporerer revers transkripsjonsprosessen direkte i amplifikasjonsreaksjonen, og forkorter reaksjonstiden.

Ulemper med NASBA:

(1) Reaksjonskomponentene er mer kompliserte.

(2) Tre typer enzymer kreves for å gjøre reaksjonskostnadene høyere.