Ct-verdi er den viktigste resultatpresentasjonsformen for fluorescerende kvantitativ PCR.Den brukes til å beregne genuttrykksforskjeller eller genkopinummer.Så hva anses Ct-verdien av fluorescenskvantifisering som rimelig?Hvordan sikre det effektive området for Ct-verdi?
Hva er Ct-verdi?
Under qPCR-amplifikasjonsprosessen, det tilsvarende antall amplifikasjonssykluser (syklusterskel) når fluorescenssignalet til det amplifiserte produktet når den innstilte fluorescensterskelen.C står for Cycle og T står for Threshold.Enkelt sagt er Ct-verdien antall sykluser som tilsvarer når den første malamplifikasjonen når en viss mengde produkt i qPCR.Den såkalte "en viss mengde produkt" vil bli ytterligere forklart senere.
Hva gjør Ct-verdien?
1. Forholdet mellom eksponentiell forsterkning, malmengde og Ct-verdi
Ideelt sett akkumuleres gener i qPCR ved eksponentiell amplifikasjon etter et visst antall sykluser.Forholdet mellom antall amplifikasjonssykluser og mengden produkter er: Amplifisert produktmengde = initial malmengde × (1+En) syklusnummer.Imidlertid er qPCR-reaksjonen ikke alltid i en ideell situasjon.Når mengden av forsterket produkt når en "viss produktmengde", er antall sykluser på dette tidspunktet Ct-verdien, og det er i den eksponentielle forsterkningsperioden.Forholdet mellom Ct-verdien og mengden startmal: Det er en lineær sammenheng mellom Ct-verdien til malen og logaritmen til startkopinummeret til malen.Jo høyere den opprinnelige malkonsentrasjonen er, desto mindre er Ct-verdien;jo lavere den opprinnelige malkonsentrasjonen er, desto større er Ct-verdien.
2. Amplifikasjonskurve, fluorescensterskel og viss PCR-produktmengde
Mengden av qPCR-amplifikasjonsprodukt presenteres direkte i form av fluorescerende signal, det vil si amplifikasjonskurven.I det tidlige stadiet av PCR er amplifikasjonen under ideelle forhold, antall sykluser er lite, produktakkumuleringen er liten, og nivået av fluorescens kan ikke tydelig skilles fra fluorescensbakgrunnen.Etter det øker fluorescensen og går inn i eksponentiell fase.Mengden av PCR-produkt kan påvises på et bestemt tidspunkt når PCR-reaksjonen bare er i eksponentiell fase, som kan brukes som "en viss mengde produkt", og startinnholdet i malen kan utledes fra dette.Derfor er fluorescenssignalintensiteten som tilsvarer en viss mengde produkt fluorescensterskelen.
I det sene stadiet av PCR viser amplifikasjonskurven ikke lenger eksponentiell amplifikasjon, og går inn i den lineære fasen og platåfasen.
3.Reproduserbarhet av Ct-verdier
Når PCR-syklusen når syklusnummeret til Ct-verdien, har den nettopp gått inn i den sanne eksponentielle amplifikasjonsperioden.På dette tidspunktet er den lille feilen ikke blitt forsterket, så reproduserbarheten til Ct-verdien er utmerket, det vil si at den samme malen forsterkes til forskjellige tider eller i forskjellige rør samtidig.Amplifikasjon, den oppnådde Ct-verdien er konstant.
1. Amplifikasjonseffektivitet En
PCR-amplifikasjonseffektivitet refererer til effektiviteten som polymerasen konverterer genet som skal amplifiseres til et amplikon.Amplifikasjonseffektiviteten når ett DNA-molekyl transformeres til to DNA-molekyler er 100 %.Amplifikasjonseffektivitet uttrykkes vanligvis som En.For å lette analysen av påfølgende artikler, introduseres kort faktorene som påvirker amplifikasjonseffektiviteten.
| Påvirkningsfaktorer | forklaring | Hvordan dømme? |
| A. PCR-hemmere | 1. Template-DNAet inneholder stoffer som hemmer PCR-reaksjonen, for eksempel proteiner eller vaskemidler.2. cDNA etter revers transkripsjon inneholder en høy konsentrasjon av mal-RNA eller RT-reagenskomponenter, som også kan hemme den påfølgende PCR-reaksjonen. | 1. Om det er forurensning kan bedømmes ved å måle forholdet mellom A260/A280 og A260/A230 eller RNA-elektroforese.2. Om cDNA er fortynnet i henhold til et visst forhold etter revers transkripsjon. |
| B. Feil primerdesign | Primere gløder ikke effektivt | Sjekk primer for primer-dimer eller hårnåler, uoverensstemmelser og noen ganger spennende introniske design. |
| C. Feil utforming av PCR-reaksjonsprogram | 1. Primere kan ikke utgløde effektivt2. Utilstrekkelig frigjøring av DNA-polymerase 3. Langvarig høytemperatur DNA-polymeraseaktivitet ble redusert | 1. Glødetemperaturen er høyere enn TM-verdien til primeren2. Pre-denatureringstiden er for kort 3. Tiden for hvert trinn i reaksjonsprosedyren er for lang |
| D. Utilstrekkelig blanding av reagenser eller pipeteringsfeil | I reaksjonssystemet er den lokale konsentrasjonen av PCR-reaksjonskomponenter for høy eller ujevn, noe som resulterer i ikke-eksponentiell amplifikasjon av PCR-amplifikasjon | |
| E. Amplicon Lengde | Lengden på amplikonet er for lang, over 300bp, og amplifikasjonseffektiviteten er lav | Sjekk at amplikonlengden er mellom 80-300bp |
| F. Påvirkning av qPCR-reagenser | Konsentrasjonen av DNA-polymerase i reagenset er lav eller konsentrasjonen av ioner i bufferen er ikke optimalisert, noe som resulterer i at Taq-enzymaktiviteten ikke når maksimum | Bestemmelse av amplifikasjonseffektivitet ved standardkurve |
2.Utvalg av Ct-verdier
Ct-verdier varierer fra 15-35.Hvis Ct-verdien er mindre enn 15, anses det at amplifikasjonen er innenfor rekkevidden av basislinjeperioden og fluorescensterskelen er ikke nådd.Ideelt sett er det et lineært forhold mellom Ct-verdien og logaritmen til det første kopinummeret til malen, det vil si standardkurven.Gjennom standardkurven, når amplifikasjonseffektiviteten er 100 %, er den beregnede Ct-verdien for å kvantifisere enkeltkopitallet til genet rundt 35. Hvis det er større enn 35, er det initiale kopitallet til malen teoretisk mindre enn 1, noe som kan anses som meningsløst.
For forskjellige gen-Ct-områder, på grunn av forskjellen i genkopiantall og amplifikasjonseffektivitet i den innledende malmengden, er det nødvendig å lage en standardkurve for genet og beregne det lineære deteksjonsområdet til genet.
3. Påvirkningsfaktorer av Ct-verdi
Fra forholdet mellom antall amplifikasjonssykluser og mengde produkt: mengde amplifisert produkt = mengde initial mal × (1+En) syklusnummer, kan det ses at under ideelle forhold vil mengden av initial template og En ha en negativ innvirkning på Ct-verdien.Forskjellen i malkvalitet eller amplifikasjonseffektivitet vil føre til at Ct-verdien blir for stor eller for liten.
4.Ct-verdien er for stor eller for liten
Innleggstid: 22. februar 2023
