Hørselstap (HL) er den vanligste sensoriske funksjonshemmingssykdommen hos mennesker.I utviklede land er omtrent 80 % av tilfellene av prelingual døvhet hos barn forårsaket av genetiske faktorer.De vanligste er enkeltgendefekter (som vist i fig. 1), 124 genmutasjoner er funnet å være assosiert med ikke-syndromisk hørselstap hos mennesker, resten er forårsaket av miljøfaktorer.Et cochleaimplantat (en elektronisk enhet plassert i det indre øret som gir elektrisk stimulering direkte til hørselsnerven) er det desidert mest effektive alternativet for å behandle alvorlig HL, mens et høreapparat (en ekstern elektronisk enhet som konverterer og forsterker lydbølger) kan hjelpe pasienter med moderat HL.Imidlertid er det for øyeblikket ingen medisiner tilgjengelig for å behandle arvelig HL (GHL).De siste årene har genterapi fått økende oppmerksomhet som en lovende tilnærming til å behandle dysfunksjon i indre øre.

Figur 1.Fordeling av døvhetsassosiert variasjonstype.[1]

Nylig publiserte forskere fra Salk Institute og University of Sheffield et forskningsresultat i Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], som viste brede anvendelsesmuligheter for in vivo genterapi av arvelig døvhet.Uri Manor, assisterende forskningsprofessor ved Salk Institute og direktør for Waitt Center for Advanced Biophotonics, sa at han ble født med alvorlig hørselstap og følte at å gjenopprette hørselen ville være en fantastisk gave.Hans tidligere forskning fant at Eps8 er et aktinregulerende protein med aktinbindings- og avdekningsaktiviteter;i cochlea hårceller, proteinkomplekset dannet av Eps8 med MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 og GNAI3 finnes hovedsakelig i de fleste Spissene til lange stereocilier, som sammen med MYO15A lokaliserer BAIAP2L2 på tuppen av kortere stereocilia, er nødvendig for vedlikehold av hårbunter.Derfor kan Eps8 regulere lengden på stereocilia av hårceller, noe som er avgjørende for normal hørselsfunksjon;Eps8-sletting eller -mutasjon vil føre til korte stereocilier, som gjør at den ikke klarer å konvertere lyd til elektriske signaler for hjerneoppfatning, noe som igjen fører til døvhet..Samtidig fant samarbeidspartner Walter Marcotti, professor ved University of Sheffield, at hårceller ikke kan utvikle seg normalt i fravær av Eps8.I denne studien gikk Manor og Marcotti sammen for å undersøke om å legge Eps8 til stereociliære celler kunne gjenopprette funksjonen deres og i sin tur forbedre hørselen hos mus.Forskerteamet brukte den adenoassosierte virusvektoren (AAV) Anc80L65 for å levere den kodende sekvensen som inneholder villtype EPS8 inn i sneglehuset til Eps8-/- nyfødte P1-P2-mus ved injeksjon av runde vindumembraner;i musecochlea hårceller Funksjonen til stereocilia ble reparert før de modnet;og reparasjonseffekten var preget av bildeteknologi og måling av stereocilia.Resultatene viste at Eps8 økte lengden på stereocilia og gjenopprettet hårcellefunksjonen i lavfrekvente celler.De fant også ut at cellene over tid så ut til å miste evnen til å bli reddet av denne genterapien.Implikasjonen er at denne behandlingen kan trenge å administreres in utero, da Eps8-/- hårceller kan ha modnet eller akkumulert skade som ikke kan repareres etter at musene ble født."Eps8 er et protein med mange forskjellige funksjoner, og det er fortsatt mye å utforske," sa Manor.Fremtidig forskning vil inkludere å undersøke effekten av Eps8 genterapi for å gjenopprette hørselen på ulike utviklingsstadier, og om det kan være mulig å forlenge behandlingsmulighetene.Tilfeldigvis publiserte professor KarenB Avraham ved Tel Aviv University i Israel i november 2020 resultatene sine i tidsskriftet EMBO Molecular Medicine [3], ved å bruke en innovativ genterapiteknologi for å lage et ufarlig syntetisk adeno-assosiert virus AAV9-PHP.B, Genfeilen i hårcellene til Syne4-/- mus ble reparert ved å injisere et virus som bærer kodingssekvensen til Syne4 inn i det indre øret til mus, slik at det kan komme inn i hårcellene og frigjøre det bårne genetiske materialet, slik at de kan modnes og fungere normalt (som i fig. 2).

Fig. 2.Skjematisk representasjon av indre øres anatomi, med fokus på organet til Corti og den cellulære funksjonen til nesprin-4.

Man kan se at bruk av genterapi for å oppnå formålet med å behandle arvelige sykdommer på gennivå ved å sette inn, fjerne eller korrigere eventuelle muterte gener for behandling (det vil si å kontrollere de genetiske endringene i sykdommen) har høy klinisk effekt.søknadsmuligheter.De nåværende genterapimetodene for genetisk mangelfull døvhet kan deles inn i følgende kategorier:

generstatning

Generstatning er uten tvil den mest "enkle" formen for genterapi, basert på å identifisere og erstatte et defekt gen med en normal eller villtype kopi av genet.Første vellykkede indre øre-genterapistudie for hørselstap forårsaket av delesjon av det vesikulære glutamattransportør 3 (VGLUT3) genet;AAV1-mediert levering av eksogen VGLUT3-overekspresjon i indre øre-hårceller (IHCs) kan resultere i vedvarende hørselsgjenoppretting, delvis båndsynaptisk morfologigjenoppretting og konvulsive responser [4].Imidlertid, i eksemplene inkludert de to AAV-leverte generstatningene beskrevet i introduksjonen ovenfor, er det viktig å merke seg at musemodellene som brukes for visse typer arvelige hørselstapsforstyrrelser i gensletting er tidsmessig forskjellige fra mennesker, og hos P1-mus er det indre øret i det modne utviklingsstadiet.I kontrast er mennesker født med et modent indre øre.Denne forskjellen forhindrer mulig anvendelse av museresultatene til behandling av humane arvelige døvhetssykdommer med mindre genterapi leveres til modne museører.

Genredigering: CRISPR/Cas9

Sammenlignet med "generstatning", har utviklingen av genredigeringsteknologi brakt begynnelsen av å behandle genetiske sykdommer fra roten.Viktigere er at genredigeringsmetoden veier opp for manglene ved tradisjonelle overekspresjonsgenterapimetoder som ikke egner seg for dominerende arvelige døvhetssykdommer, og problemet med at overekspresjonsmetoden ikke varer lenge.Etter at kinesiske forskere spesifikt slo ut Myo6C442Y-mutantallelen i Myo6WT/C442Y-mus ved å bruke AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2-genredigeringssystemet, og innen 5 måneder etter knockouten ble musene gjenopprettet. Den auditive funksjonen til modellen ble gjenopprettet;samtidig ble det også observert at overlevelsesraten for hårceller i det indre øret ble forbedret, formen på flimmerhårene ble regelmessig, og de elektrofysiologiske indikatorene ble korrigert [5].Dette er den første studien i verden som bruker CRISPR/Cas9-teknologi for behandling av arvelig døvhet forårsaket av Myo6-genmutasjon, og det er en viktig forskningsfremgang innen genredigeringsteknologi for behandling av arvelig døvhet.Den kliniske oversettelsen av behandling gir et solid vitenskapelig grunnlag.

Leveringsmetoder for genterapi

For at genterapi skal lykkes, kan ikke nakne DNA-molekyler trenge effektivt inn i celler på grunn av deres hydrofilisitet og negative ladning av fosfatgrupper, og for å sikre integriteten til de tilførte nukleinsyremolekylene, må en sikker og effektiv metode velges.Det tilførte DNAet leveres til målcellen eller vevet.AAV er mye brukt som leveringsmiddel for sykdomsbehandling på grunn av sin høye smittsomme effekt, lave immunogenisitet og brede tropisme til ulike vevstyper.For tiden har et stort forskningsarbeid bestemt tropismen til forskjellige undertyper av AAV i forhold til forskjellige celletyper i musesneglen.Ved å bruke AAV-leveringskarakteristikker kombinert med cellespesifikke promotere kan man oppnå cellespesifikk uttrykk, noe som kan redusere effekter utenfor målet.I tillegg, som et alternativ til tradisjonelle AAV-vektorer, utvikles stadig nye syntetiske AAV-vektorer og viser overlegen transduksjonsevne i det indre øret, hvorav AAV2/Anc80L65 er den mest brukte.Ikke-virale leveringsmetoder kan videre deles inn i fysiske metoder (mikroinjeksjon og elektroporering) og kjemiske metoder (lipidbaserte, polymerbaserte og gullnanopartikler).Begge tilnærmingene har blitt brukt i behandlingen av arvelige døvhetslidelser og har vist ulike fordeler og begrensninger.I tillegg til leveringsvehikelen for genterapi som en bærer, kan forskjellige tilnærminger for in vivo-genadministrering benyttes basert på forskjellige målcelletyper, administreringsveier og terapeutisk effektivitet.Den intrikate strukturen til det indre øret gjør det vanskelig å nå målceller og distribusjonen av genomredigeringsmidler er langsom.Den membranøse labyrinten er lokalisert innenfor den benete labyrinten av tinningbenet og inkluderer cochleakanalen, halvsirkelformet kanal, utrikkel og ballong.Dens relative isolasjon, minimal lymfesirkulasjon og separasjon fra blodet med en blod-labyrint-barriere begrenser den effektive systemiske leveringen av terapeutika kun til neonatale mus.For å oppnå virale titere egnet for genterapi, er direkte lokal injeksjon av virale vektorer i det indre øret nødvendig.Etablerte injeksjonsveier inkluderer [6]: (1) rund vindu membran (RWM), (2) trakeostomi, (3) endolymfatisk eller perilymfatisk cochleostomi, (4) rund vindu membran pluss Tube fenestration (CF) (som i fig. 3).

Fig3.Levering av indre øre av genterapi.

Selv om det er gjort mange fremskritt innen genterapi, basert på kliniske translasjonsmål, må det gjøres mer arbeid før genterapi kan bli et førstelinjebehandlingsalternativ for pasienter med genetiske sykdommer, spesielt i utviklingen av sikre og effektive vektorer og leveringsmetode.Men vi tror at i nær fremtid vil disse typer behandlinger bli en stift i personlig terapi og vil ha en enorm positiv innvirkning på livene til mennesker med genetiske lidelser og deres familier.

Foregene har også lansert et high-throughput screeningsett for målrettede gener, som er raskt og kan utføre revers transkripsjon og qPCR-reaksjoner uten RNA-ekstraksjon.

Produktlenker

Cell Direct RT-qPCR-sett—Taqman/SYBR GREEN I

For mer produktinformasjon, vennligst kontakt:

overseas@foregene.com