Det enestående trekk ved PCR-reaksjonen er dens store amplifikasjonskapasitet og ekstremt høye følsomhet.For å forbedre PCR-ytelsen og deteksjonseffektiviteten, er vi forpliktet til å forbedre PCR-amplifikasjonskapasiteten og deteksjonsfølsomheten, men hodepinen er i ferd med eksperimentet.Falske positiver forekommer ofte, og en svært liten mengde prøvekrysskontaminering eller PCR-produktkontaminering kan forårsake falske positive i eksperimentet.
Fem typer PCR-produktforurensning
Det er mange årsaker til PCR-kontaminering, som grovt sett kan deles inn i følgende kategorier:
Prøvekontaminering er hovedsakelig forårsaket av kontaminering av beholderen for å samle prøven, eller når prøven er plassert, lekkes den ut av beholderen på grunn av løs forsegling, eller prøven festes til utsiden av beholderen, noe som forårsaker krysskontaminering;Kontaminering fører til kontaminering mellom prøver;noen mikrobielle prøver, spesielt virus, kan spre seg med aerosoler eller danne aerosoler, noe som resulterer i gjensidig kontaminering.
Hovedårsaken er at prøvepistolen, beholderen, dobbeltdestillert vann og andre løsninger blir kontaminert av PCR-nukleinsyremalen under tilberedningen av PCR-reagenser.
I molekylærbiologiske laboratorier og noen laboratorier som bruker klonede plasmider som positive kontroller, er problemet med klonet plasmidkontaminering også vanlig.Fordi innholdet av kloningsplasmid i enhetsvolum er ganske høyt, og det trengs flere verktøy og reagenser i renseprosessen, og plasmidet i levende celler er svært sannsynlig forurenset på grunn av den sterke veksten og reproduksjonsevnen til levende celler.
Kontaminering av amplifiserte produkter er det vanligste forurensningsproblemet i PCR-reaksjoner.Fordi kopimengden av PCR-produkt er stor (vanligvis 1013 kopier/ml), som er langt høyere enn grensen for PCR-deteksjonskopiantall, kan en svært liten mengde PCR-produktkontaminering forårsake falske positiver.
Aerosolforurensning er den mest sannsynlige formen for forurensning av PCR-produkter, og den er også den letteste å bli oversett.Det dannes av friksjonen mellom væskeoverflaten og luften.Vanligvis kan aerosolforurensning dannes når lokket åpnes, når prøven aspireres, eller til og med når reaksjonsrøret ristes kraftig.Ifølge beregninger kan en aerosolpartikkel inneholde 48 000 eksemplarer, så forurensningen forårsaket av den er et problem som fortjener spesiell oppmerksomhet.
Spesielt testlaboratorier bruker ofte det samme paret primere for å teste et bestemt gen.Over tid vil en stor mengde PCR-produktkontaminering forekomme i laboratorierommet.Når en slik forurensning først oppstår, er det vanskelig å eliminere den på kort tid.
For de tre første typene forurensning kan vi bruke effektive midler for å unngå, men forurensningen forårsaket av PCR-produkter er vanskelig å forhindre, spesielt ved bygging av ikke-standard PCR-laboratorier.I PCR-prosessen, når pipettespissen suger og blåser væsken, og PCR-rørdekselet åpnes, vil det dannes en aerosol.DNA-molekylene som bæres av aerosolen (en aerosol kan bære titusenvis av DNA) er vanskelig å eliminere fordi de flyter i luften.Når neste runde med PCR-eksperimenter er introdusert, vil falske positive uunngåelig oppstå.
Som vist i figuren nedenfor, forsterket den negative kontrollen også det tilsvarende båndet av interesse:
Den første delen av denne utgaven av PCR-forurensning og forebygging introduseres her.Neste utgave vil gi deg den andre delen "Forebygging av PCR-produktkontaminering", så følg med!
Innleggstid: 25. juli 2017
