Direkte PCR er en reaksjon som direkte bruker dyre- eller plantevev for amplifikasjon uten nukleinsyreekstraksjon.På mange måter fungerer direkte PCR som vanlig PCR

Hovedforskjellen er den tilpassede bufferen som brukes i direkte PCR, prøven kan direkte utsettes for PCR-reaksjonen uten nukleinsyreekstraksjon, men det er tilsvarende krav til toleransen til enzymene og kompatibiliteten til bufferen som er involvert i den direkte PCR-reaksjonen.

Selv om det er mer eller mindre PCR-hemmere i vanlige prøver, kan direkte PCR fortsatt oppnå pålitelig amplifikasjon under påvirkning av enzymer og buffere.Den tradisjonelle PCR-reaksjonen krever nukleinsyre av høy kvalitet som mal, som kan hemme den jevne fremdriften av PCR-reaksjonen hvis malen inneholder proteiner og andre urenheter.Direkte PCR er for tiden en av de mer populære teknologiene innen molekylær diagnostikk.

01 Direkte PCR ble opprinnelig brukt for dyr og planter

Den tidligste anvendelsen av direkte PCR er innen dyr og planter, slik som blod, vev og hår til rotter, katter, kyllinger, kaniner, sauer, storfe, etc., planteblader og frø, etc., brukt til å studere genotyping, transgen, plasmiddeteksjon, genknockout-analyse, DNA-kildeidentifikasjon, artsanalyse og annen identifisering, S.

Disse feltene har noen fellestrekk, det vil si at målgeninnholdet er relativt høyt og nukleinsyreekstraksjon er plagsom, så direkte PCR kan ikke bare spare tid og ha en liten innvirkning på resultatene, men også spare kostnader.

Direkte PCR brukt til patogendeteksjon er et spørsmål om de siste årene, noen PCR-reagensprodusenter har gjort mye innsats i denne retningen når de har laget innovasjon.Spesielt i denne COVID-19-epidemien, har mange slike deteksjonsprodukter dukket opp på markedet, slik som SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) forsket på og utviklet av Foregene, som bruker sanntids RT PCR-teknologi (rRT-PCR) for kvalitativ påvisning av SARS-CoVynge-2 eller svavelsyreprøver hos mennesker s.

Foregene er et av selskapene som bruker Direct PCR-teknologi, for påvisning av normal ORF1ab, N, E ogvariant avstamninger av nukleinsyrer i humane nasofaryngeale eller orofaryngeale vattpinneprøver, slik som SARS-CoV-2 B.1.1.7-avstamning (UK), B.1.351-avstamning (ZA), B.1.617-avstamning (IND) og P.1-avstamning (BR).

02  Reagenser som trengs for direkte PCR

Prøv lysat

Prøvelysatet kan konfigureres selv eller kjøpes.Forskjellen i sammensetningen av ulike merker lysat vil gjøre lyseringsevnen forskjellig, og da vil lyseringstiden være litt forskjellig.For eksempel, for forberedelse av dyrevevsprøver, anbefales generelt 30 minutter eller over natten lysering, og lyseringsløsningen for virus varierer fra 3-10 minutter.

PCR-masterblanding

Det anbefales å bruke hot-start DNA-polymerase for å forbedre spesifikk amplifikasjon og øke amplifikasjonsevnen.Kjernen i direkte PCR er en svært tolerant polymerase.

Eliminer eller inhiber komponenter i prøven som påvirker DNA-amplifisering

Etter at prøven er behandlet med lysatet, vil proteiner, lipider og andre cellerester frigjøres, disse stoffene vil hemme PCR-reaksjonen.Derfor krever direkte PCR tillegg av tilsvarende fjerning eller inhibitorer for å redusere påvirkningen av disse faktorene.

03  En samling av fem kunnskapspunkter for direkte PCR

For det første er Direct PCR-teknologi en direkte PCR-teknologi for ulike biologiske prøver.Under denne tekniske tilstanden er det ikke nødvendig å separere og ekstrahere nukleinsyren, bruke vevsprøven direkte som objekt og legge til målgenprimerne som skal utføre PCR-reaksjonen.

For det andre er Direct PCR-teknologi ikke bare en tradisjonell DNA-template-amplifikasjonsteknologi, men inkluderer også RNA-template revers transkripsjon PCR.

For det tredje utfører Direct PCR-teknologi ikke bare rutinemessige kvalitative PCR-reaksjoner på vevsprøver, men inkluderer også qPCR-reaksjoner i sanntid, som krever at reaksjonssystemet har sterk anti-bakgrunnsfluorescensinterferensevne og endogen fluorescens slukker den antagonistiske evnen.

For det fjerde trenger prøvene som er målrettet av Direct PCR-teknologien bare frigjøring av nukleinsyremaler, og fjerner ikke proteiner, polysakkarider, salioner osv. som forstyrrer PCR-reaksjonen.Noe som krever at nukleinsyrepolymerasen og PCR-blandingen i reaksjonssystemet har utmerket motstand og tilpasningsevne for å sikre enzymaktivitet og replikasjonsnøyaktighet under komplekse forhold.

For det femte er vevsprøven målrettet av Direct PCR-teknologi uten noen nukleinsyreanrikningsbehandling og mengden maling svært liten, noe som krever at reaksjonssystemet har ekstremt høy følsomhet og amplifikasjonseffektivitet.