Jeg tror at alle alltid vil støte på slike eller slike problemer når de utfører PCR-reaksjoner, men de fleste av dem kan klassifiseres i to hovedproblemer:

For lite amplifikasjon av genmalen (amplifikasjon);
For mye ikke-målgenamplifikasjon.
Bruk av tilsetningsstoffer er en av de vanlige strategiene for å løse disse problemene.Vanligvis har tilsetningsstoffenes rolle to aspekter:
sekundær strukturav gener (sekundær struktur);
Reduser ikke-spesifikk priming.
I dag vil redaktøren kort introdusere deg de vanlige tilsetningsstoffene i PCR-reaksjoner og deres funksjoner.
Tilsetningsstoffer som reduserer sekundærstruktur
sulfoksid(DMSO)
genprøvermed høyt GC-innhold.Imidlertid reduserer DMSO også Taq-polymeraseaktiviteten betydelig.Derfor må alle balansere maltilgjengelighet og aktiviteten til polymerasen.Redaktøren foreslår at du kan prøve forskjellige konsentrasjoner av DSMO, for eksempel fra 2 % til 10 %, for å finne konsentrasjonen som passer eksperimentet ditt.
Ikke-ioniske vaskemidler
Ikke-ioniske vaskemidler, slik som 0,1-1 % Triton X-100, Tween 20 eller NP-40, reduserer vanligvis DNA-sekundærstrukturen.Selv om dette kan øke amplifikasjonen av template-genet, vil det også forårsake problemer med ikke-spesifikk amplifikasjon.Så disse tilsetningsstoffene fungerer bra for PCR-reaksjoner med lavt utbytte uten rusk, men ikke så godt for relativt urene PRC-reaksjoner.En annen fordel med ikke-ioniske vaskemidler er reduksjonen av SDS-forurensning.Vanligvis under DNA-ekstraksjonsprosessen vil SDS bli brakt til PCR-trinnet, som i stor grad hemmer aktiviteten til polymerasen.Derfor kan tilsetning av 0,5 % Tween-20 eller Tween-40 til reaksjonen nøytralisere de negative effektene av SDS.
Betain_
Betain kan forbedre DNA-amplifisering ved å redusere sekundær strukturdannelse og er generelt et "mysterium" til kommersielle PCR-sett.Hvis du ønsker å bruke betain, bør du legge betain eller betain mono-hydrat (Betaine eller Betaine mono-hydrat), men ikke betain hydrochloride (Betaine HCl), juster til en sluttkonsentrasjon på 1-1,7M.Betain kan også bidra til å forbedre spesifisiteten fordi det eliminerer avhengigheten av baseparsammensetningen av DNA-smelting/DNA-denaturering.
Tilsetningsstoffer for å redusere uspesifikk grunning
Formamid
Formamid er et ofte brukt organisk PCR-tilsetningsstoff.Den kan kombineres med hovedspor og mindre spor i DNA, og reduserer derved stabiliteten til master-DNA-dobbelhelixen og senker smeltetemperaturen til DNA.Konsentrasjonen av formamid brukt i PCR-eksperimenter er vanligvis 1%-5%.
Tetrametylammoniumklorid( TMAC)
Tetrametylammoniumklorid kan øke spesifisiteten til hybridisering (hybridiseringsspesifisitet) og øke smeltetemperaturen til DNA.Dermed kan TMAC fjerne uspesifikk priming og redusere feilbinding av DNA og RNA.Hvis du brukerdegenererte primerei PCR-reaksjonen, husk å legge til TMAC, som vanligvis brukes i en konsentrasjon på 15-100mM.
Andre vanlige tilsetningsstoffer
I tillegg til de to kategoriene tilsetningsstoffer nevnt ovenfor, er det mange vanlige tilsetningsstoffer i PCR-reaksjoner, selv om de har forskjellige funksjoner, er de også svært viktige.
Magnesiumion
Magnesiumion er en uunnværlig kofaktor (kofaktor) av polymerase, det vil si at uten magnesiumion er polymerase inaktiv.Imidlertid kan for mye magnesiumioner også påvirke effektiviteten til polymerasen.Konsentrasjonen av magnesiumioner i hver PCR-reaksjon vil variere.Chelaterende midler (som EDTA eller sitrat), konsentrasjonen av dNTP-er og proteiner påvirker alle konsentrasjonen av magnesiumioner.Så hvis du har problemer med PCR-eksperimentet ditt, kan du prøve å endre forskjellige magnesiumionekonsentrasjoner, for eksempel fra 1,0 til 4,0 mM, med et intervall på 0,5–1 mM i mellom.
Det er verdt å merke seg at flere fryse-tine-sykluser kan føre til konsentrasjonsstratifisering av magnesiumkloridløsningen.Derfor må du løse den helt opp før hver bruk, og blande den godt før du bruker den.
Bovint serumalbumin(Bovint albumin, BSA)
I molekylærkjemieksperimenter er bovint serumalbumin et svært vanlig tilsetningsstoff, spesielt i restriksjonsenzymfordøyelse og PCR-eksperimenter.I PCR-reaksjoner er BSA nyttig for å redusere forurensninger som fenolforbindelser.Og det sies også at det kan redusere adhesjonen av reaktanter til veggen av reagensrøret.I PCR-reaksjonen kan vanligvis konsentrasjonen av tilsatt BSA nå 0,8 mg/ml.
 
Relaterte produkter:
PCR-helt(med fargestoff)
PCR-helt