I det tidlige stadiet av utbruddet, på grunn av den raske utviklingen, er rask diagnostisering av mistenkte pasienter nøkkelen til å forebygge COVID-19.Noen godkjente nukleinsyredeteksjonsreagenser har kort utviklingstid, og det er problemer som forhastet ytelsesbekreftelse, utilstrekkelig reagensoptimalisering og store forskjeller mellom batcher;Problemene til ulike kliniske laboratorier i ulike aspekter av nukleinsyredeteksjonsprosessen kan også påvirke nøyaktigheten av nukleinsyredeteksjonsresultater.Denne artikkelen vil fokusere på nøkkellenkene og punktene i den nåværende SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjonen, og analysere problemene med falsk negativ og positiv ny undersøkelse av laboratorietukleinsyredeteksjon og klinisk inkonsekvens.

Prinsipper for SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjon

SARS-CoV-2 er et RNA-virus med en genomsekvens på ca. 29 kb, med 10 gener, som effektivt kan kode for 10 proteiner.Virus er sammensatt av RNA og protein, og det ytterste laget er et ytre belegg som består av lipider og glykoproteiner.På innsiden pakker proteinkapsiden RNA inn i det, og beskytter derved det lett nedbrytbare RNA (P1).

P1 Struktur av SARS-COV-2

Virus invaderer celler gjennom spesifikke celleoverflatereseptorer for å forårsake infeksjon, og bruker vertsceller til å replikere.

Prinsippet for viral nukleinsyredeteksjon er å eksponere det virale RNA gjennom et cellelysat, og deretter bruke sanntids fluorescerende revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for deteksjon.

Nøkkelen til deteksjonsprinsippet er å bruke primere og prober for å oppnå "målrettet matching" av nukleinsyresekvenser, det vil si å finne nukleinsyresekvensen til SARS-CoV-2 som er forskjellig fra andre virus i rundt 30 000 baser (likheten mellom nukleinsyre og andre virus) "Low" område), design primere og prober.

Primerne og probene er svært matchet med den spesifikke regionen av SARS-CoV-2-nukleinsyre, det vil si at spesifisiteten er veldig sterk.Når sanntids fluorescerende RT-PCR-amplifikasjonsresultatet av prøven som skal testes er positivt, beviser det at SARS-CoV-2 er tilstede i prøven.Se P2.

P2-trinn for SARS-CoV-2-nukleinsyrebestemmelse (sanntidsfluorescerende RT-PCR)

Betingelser og krav til laboratoriet for SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjon

Nukleinsyretestlaboratorier er de mest ideelle for miljøer med negativt trykk, og de bør være oppmerksomme på trykkovervåking, holde luften flytende og eliminere aerosoler.Personell som tester nukleinsyre må ha tilsvarende kvalifikasjoner, få relevant opplæring i polymerasekjedereaksjon og bestå vurderingen.Laboratoriet bør være strengt administrert, sonet på plass, og irrelevant personell er strengt forbudt å komme inn.Det rene området bør ventileres og desinfiseres på plass.Relevante gjenstander plasseres i soner, rene og skitne separeres, skiftes ut i tide og dekontamineres på plass.Rutinemessig desinfeksjon: Klorholdig desinfeksjonsmiddel er hovedløsningen for større områder, og 75 % alkohol kan brukes på små områder.En god måte å håndtere aerosoler på er å åpne vinduer for ventilasjon, og luftdesinfeksjon kan også utføres ved hjelp av ultrafiolette stråler, filtrering og luftdesinfeksjon.

Nøkkelkoblinger og parametere for SARS-CoV-2-nukleinsyrebestemmelse (sanntidsfluorescerende RT-PCR)

Selv om laboratorier generelt følger nøye med på "deteksjon av nukleinsyre", er "ekstraksjon" av nukleinsyre også et av nøkkeltrinnene for vellykket påvisning, som er nært knyttet til innsamling og lagring av virusprøver.

For tiden bruker de mest brukte luftveisprøvene, som nasofaryngeale vattpinner, den andre metoden, som er en inaktiveringsløsning (konservering) fremstilt basert på nukleinsyreekstraksjon og lyseringsløsning.På den ene siden kan denne viruskonserveringsløsningen denaturere proteinet til viruset, miste aktiviteten og ikke lenger være smittsom, og forbedre sikkerheten til transport- og deteksjonsstadiet;på den annen side kan den direkte knekke viruset for å frigjøre nukleinsyren, eliminere det nukleinsyrenedbrytende enzymet og forhindre viruset.RNA brytes ned.

En virusprøvetakingsløsning fremstilt på basis av lyseringsløsning for nukleinsyreekstraksjon.Hovedkomponentene er balanserte salter, etylendiamintetraeddiksyre-chelateringsmiddel, guanidinsalt (guanidinisotiocyanat, guanidinhydroklorid, etc.), anionisk overflateaktivt middel (dodekan) Natriumsulfat), kationisk overflateaktivt middel (tetradecyltrimetylammoniumoksalat), diti-hydroksykinol, 8-hydroksykinol-komponenter og flere andre proteinkomponenter, K.For tiden finnes det mange typer nukleinsyreekstraksjonssett, og forskjellige nukleinsyreekstraksjons- og rensereagenser brukes.Selv om det samme nukleinsyreekstraksjons- og rensereagenset brukes, er ekstraksjonsprosedyrene for hvert sett forskjellige.

For tiden velges nukleinsyredeteksjonssettet som er godkjent av National Medical Products Administration basert på ORF1ab-, E- og N-genene i SARS-CoV-2-genomet.Deteksjonsprinsippene for forskjellige produkter er i utgangspunktet de samme, men deres primere og probedesign er forskjellige.Det er enkeltmålsegmenter (ORF1ab), doble målsegmenter (ORF1ab, N eller E), og tremålssegmenter (ORF1ab, N og E).Forskjellen mellom deteksjon og tolkning, nukleinsyreekstraksjon og fluorescerende RT-PCR-reaksjonssystem i sanntid bør referere til de relevante kitinstruksjonene, og det anbefales at brukere følger tolkningsmetoden som er spesifisert i settinstruksjonene for tolkning.De vanlige regionene, primerne og probesekvensene amplifisert ved sanntids fluorescerende RT-PCR er vist i P3.

P3 Plasseringen av SARS-CoV-2 amplikonmålet på genomet og sekvensen til primere og prober

Tolkning av resultatene av SARS-CoV-2 nukleinsyrebestemmelse (Real-Time fluorescerende RT-PCR)

"Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Second Edition)" klargjorde for første gang kriteriene for å bedømme resultatene av enkeltgenamplifikasjon:

1. Ingen Ct eller Ct≥40 er negativ;

2. Ct<37 er positivt;

3. Ct-verdien på 37-40 er gråskalaområdet.Det anbefales å gjenta forsøket.Hvis resultatet av å gjøre om Ct<40 og amplifikasjonskurven har tydelige topper, blir prøven vurdert som positiv, ellers er den negativ.»

Den tredje utgaven av veiledningen og den fjerde utgaven av veiledningen videreførte kriteriene ovenfor.På grunn av de forskjellige målene som brukes i kommersielle sett, ga imidlertid ikke den nevnte tredje utgaven av veiledningen kriteriene for å bestemme kombinasjonen av mål, og understreker at instruksjonene gitt av produsenten skal gjelde.Fra og med den femte utgaven av retningslinjene har to mål blitt avklart, spesielt vurderingskriteriene for et enkelt mål som er vanskelig å bedømme.Det vil si at hvis laboratoriet ønsker å bekrefte at et tilfelle er positivt for SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjon, må følgende oppfylles 1 av 2 betingelser:

(1) To mål av SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) i samme prøve testes positive ved sanntids fluorescerende RT-PCR.Hvis et enkelt mål er positivt, kreves ny prøvetaking og ny testing.Hvis testresultatene er Hvis enkeltmålet fortsatt er positivt, vurderes det som positivt.

(2) To prøver av sanntids fluorescerende RT-PCR viste et enkelt mål positivt på samme tid, eller to prøver av samme type viste et enkelt mål positivt testresultat, som kan bedømmes som positivt.Retningslinjene understreker imidlertid også at de negative resultatene av nukleinsyretesting ikke kan utelukke SARS-CoV-2-infeksjon.Faktorer som kan forårsake falske negativer må utelukkes, inkludert dårlig prøvekvalitet (respirasjonsprøver fra orofarynx og andre deler), prøvetaking for tidlig eller for sent, Prøver ble ikke lagret, transportert og behandlet på riktig måte, og teknologien i seg selv hadde problemer (virusvariasjon, PCR-hemming), etc.

Årsaker til falske negativer i SARS-CoV-2-deteksjonen

Konseptet "falsk negativ" i nukleinsyretesting som for tiden er bekymret, refererer ofte til "falske negativer" der nukleinsyretestresultatene er inkonsistente med kliniske manifestasjoner, det vil si at kliniske symptomer og bilderesultater er sterkt mistenkt for COVID-19, men nukleinsyretester er alltid "negative" mange ganger.Det kliniske laboratoriesenteret til National Health Commission forklarte den "falsk negative" SARS-CoV-2-testen.

(1) Det er en viss mengde virus i cellene til den infiserte personen.Eksisterende data viser at etter at kroppen er infisert av viruset, kommer viruset inn i halsen gjennom nesen og munnen, deretter til luftrøret og bronkiene, og når deretter alveolene.Den smittede personen vil oppleve inkubasjonsperioden, milde symptomer, og deretter prosessen med alvorlige symptomer, og forskjellige stadier av sykdommen.Og mengden virus som finnes i forskjellige deler av kroppen er forskjellig.

Når det gjelder viral belastning av celletyper, alveolære epitelceller (nedre luftveier)> luftveisepitelceller (øvre luftveier)> fibroblaster, endotelceller og makrofager, etc.;fra prøvetypen, alveolær skyllevæske (den mest utmerkede)>dyp hoste-sputum>nasopharyngeal vattpinne>orofaryngeal vattpinne>blod.I tillegg kan viruset også påvises i avføring.Men med tanke på praktiske operasjoner og aksept av pasienter, er den vanligste kliniske prøven orofaryngeal vattpinne>nasofaryngeal vattpinne> bronkial skyllevæske (kompleks operasjon) og dypt oppspytt (vanligvis tørr hoste, vanskelig å få tak i).

Derfor er mengden virus i cellene i orofarynx eller nasopharynx hos noen pasienter liten eller ekstremt lav.Hvis det kun tas prøver av orofarynx eller nasopharynx for testing, vil den virale nukleinsyren ikke bli oppdaget.

(2) Ingen virusholdige celler ble samlet under prøvetaking, eller viral nukleinsyre ble ikke effektivt bevart.

[① Feil innsamlingssted, for eksempel ved innsamling av orofaryngeale vattpinner, er innsamlingsdybden ikke nok, de innsamlede nasofaryngeale vattpinner samles ikke dypt i nesehulen osv. De fleste cellene som samles inn kan være virusfrie celler;

②Prøveservietter brukes feil.For eksempel anbefales syntetiske fibre som PE-fiber, polyesterfiber og polypropylenfiber for materialet til vattpinnehodet.Naturlige fibre som bomull brukes i faktisk drift (sterk adsorpsjon av protein og ikke lett å vaske ut) Og nylonfibre (dårlig vannabsorpsjon, noe som fører til utilstrekkelig prøvetakingsvolum);

③ Feil bruk av viruslagringsrør, for eksempel misbruk av polypropylen- eller polyetylenplastlagringsrør som er lette å absorbere nukleinsyrer (DNA/RNA), noe som resulterer i en reduksjon i konsentrasjonen av nukleinsyre i lagringsløsningen.I praksis anbefales det å bruke polyetylen-propylen-polymerplast og noen spesialbehandlede polypropylen-plastbeholdere for å lagre virale nukleinsyrer.]

[① Feil innsamlingssted, for eksempel ved innsamling av orofaryngeale vattpinner, er innsamlingsdybden ikke nok, de innsamlede nasofaryngeale vattpinner samles ikke dypt i nesehulen osv. De fleste cellene som samles inn kan være virusfrie celler;

②Prøveservietter brukes feil.For eksempel anbefales syntetiske fibre som PE-fiber, polyesterfiber og polypropylenfiber for materialet til vattpinnehodet.Naturlige fibre som bomull brukes i faktisk drift (sterk adsorpsjon av protein og ikke lett å vaske ut) Og nylonfibre (dårlig vannabsorpsjon, noe som fører til utilstrekkelig prøvetakingsvolum);

③ Feil bruk av viruslagringsrør, for eksempel misbruk av polypropylen- eller polyetylenplastlagringsrør som er lette å absorbere nukleinsyrer (DNA/RNA), noe som resulterer i en reduksjon i konsentrasjonen av nukleinsyre i lagringsløsningen.I praksis anbefales det å bruke polyetylen-propylen-polymerplast og noen spesialbehandlede polypropylen-plastbeholdere for å lagre virale nukleinsyrer.]

(4) Den kliniske laboratoriedriften er ikke standardisert.Prøvetransport og lagringsforhold, standardisert drift av kliniske laboratorier, resultattolkning og kvalitetskontroll er nøkkelfaktorene for å sikre nøyaktigheten og påliteligheten til testresultatene.I følge resultatene av den eksterne kvalitetsevalueringen utført av det kliniske laboratoriesenteret til National Health Commission 16.–24. mars 2020, av de 844 laboratoriene som mottok gyldige resultater, var 701 (83,1 %) kvalifisert, og 143 (16,9 %) var ikke kvalifisert.Kvalifisert, de generelle laboratorietestingsforholdene er gode, men forskjellige laboratorier har fortsatt forskjeller i personellets operasjonsevne, evne til å tolke positive prøver med ett mål og kvalitetskontroll.

Hvordan redusere det falske negative ved SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjon?

Redusering av falske negativer i nukleinsyredeteksjon bør optimaliseres fra de fire aspektene ved å produsere falske negativer.

(1) Det er en viss mengde virus i cellene til den infiserte personen.Konsentrasjonen av viruset i ulike deler av kroppen til mistenkte smittede vil være forskjellig til forskjellige tider.Hvis det ikke er svelg, kan det være i bronkial skyllevæske eller avføring.Hvis flere typer prøver kan samles inn samtidig eller på forskjellige stadier av sykdomsprogresjon for testing, vil det bidra til å unngå falske negative resultater.

(2) Celler som inneholder virus bør samles inn under prøvetaking.Dette problemet kan i stor grad løses ved å styrke opplæringen av prøvesamlere.

(3) Pålitelige IVD-reagenser.Ved å utføre forskning på evaluering av deteksjonsytelse av reagenser på nasjonalt nivå, og diskutere eksisterende problemer, kan deteksjonseffektiviteten til reagenser forbedres ytterligere og analysens følsomhet kan forbedres.

(4) Standardisert drift av kliniske laboratorier.Ved å styrke opplæringen av laboratoriepersonell, kontinuerlig forbedre laboratoriekvalitetsstyringssystemet, sikre rimelige inndelinger og forbedre personellets evne til å oppdage, er det mulig å redusere falske negativer på grunn av feil laboratorieoperasjoner.

Årsaker til re-test positiv av SARS-CoV-2 nukleinsyretest hos restituerte og utskrevet pasienter

«COVID-19 Diagnosis and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)» fastsetter klart at et av kriteriene for at COVID-19 pasienter skal helbredes og skrives ut fra sykehuset er at to påfølgende luftveisprøver har en negativ nukleinsyretest (minst 24 timers mellomrom), men det er svært få SARS-CoV-2-pasienter som igjen var positive på grunn av flere nukleinsyreutskrevne pasienter.

(1) SARS-CoV-2 er et nytt virus.Det er nødvendig å ytterligere forstå dens patogene mekanisme, det fulle bildet av sykdommen forårsaket og egenskapene til sykdomsforløpet.Derfor er det på den ene siden nødvendig å styrke håndteringen av utskrevne pasienter og gjennomføre 14-dagers medisinsk observasjon.Gjennomføre oppfølging, helseovervåking og helseveiledning for å utdype forståelsen av hele prosessen med forekomst, utvikling og utfall av sykdommen.

(2) Pasienten kan bli infisert med viruset igjen.Akademiker Zhong Nanshan sa: Fordi kurerte pasienter har antistoffer, kan SARS-CoV-2 elimineres av antistoffer når de invaderer igjen.Det er mange årsaker, som kan være årsaken til den restituerte pasienten, eller det kan være relatert til mutasjonen av viruset, eller til og med årsaken til laboratorietesting.Hvis det er viruset i seg selv, kan SARS-CoV-2-mutasjonen føre til at antistoffet produsert av den restituerte pasienten er ineffektivt mot det muterte viruset.Hvis pasienten blir infisert med det muterte viruset igjen, kan nukleinsyretesten være positiv igjen.

(3) Når det gjelder laboratorietestmetoder, har hver testmetode sine begrensninger.SARS-CoV-2-nukleinsyredeteksjon skyldes valg av gensekvens, sammensetningen av reagenser, følsomheten til metoden og andre årsaker, noe som fører til at de eksisterende settene har sine egne nedre deteksjonsgrenser.Etter at pasienten er behandlet, avtar viruset i kroppen.Når virusmengden i prøven som skal testes er under den nedre deteksjonsgrensen, vil et "negativt" resultat vises.Dette resultatet betyr imidlertid ikke at viruset i kroppen har forsvunnet helt.Viruset kan være etter at behandlingen er stoppet.Resurgence», fortsett å kopiere.Derfor anbefales det å vurdere en gang i uken innen 2 til 4 uker etter utskrivning.

(4) Nukleinsyre er arvestoffet til viruset.Viruset drepes etter at pasienten har gjennomgått antiviral behandling, men de gjenværende virale RNA-fragmentene holdes fortsatt tilbake i menneskekroppen, og slippes ikke fullstendig ut av kroppen.Noen ganger, under visse omstendigheter, kan den beholdes mer.Lang tid, og på dette tidspunktet vil nukleinsyretesten være "forbigående" positiv.Med forlengelse av pasientens restitusjonstid, etter at de resterende RNA-fragmentene i kroppen gradvis er uttømt, kan nukleinsyretestresultatet bli negativt.

(5) Nukleinsyretestresultatet av SARS-CoV-2 beviser bare tilstedeværelse eller fravær av viralt RNA, og kan ikke bevise virusets aktivitet og om viruset er overførbart.Det er nødvendig å bevise om en pasient som har en positiv nukleinsyretest igjen vil bli en smittekilde igjen.Det er nødvendig å utføre viruskultur på kliniske prøver og dyrke et "levende" virus for å bevise at det er smittsomt.

Sammendrag

Oppsummert kan SARS-CoV-2 nukleinsyretest falske negativer, retest positive og andre tilstander som er inkonsistente med kliniske manifestasjoner, ikke unngås helt.Ved faktisk screening og testing anbefales det å kombinere kliniske symptomer, bildediagnostiske undersøkelser (CT) og eksperimenter Laboratorietest (nukleinsyretest + virusspesifikk antistofftest) resultater for helhetlig diagnose for å forhindre manglende diagnose og feildiagnostisering.Hvis testresultatene er funnet å være åpenbart inkonsistente med de kliniske manifestasjonene, anbefales det å gjennomføre en omfattende analyse av hele testkoblingen (prøvesamling, sirkulasjon og behandlingskoblinger) for å utelukke SARS-CoV-2-virus tidlig infeksjon, tilbakevendende infeksjon eller kombinert med andre luftveisvirusinfeksjoner, etc. mulig.Hvis forholdene tillater det, anbefales det å samle inn mer sensitive prøver som sputum eller alveolær skyllevæske for ny undersøkelse.

Relaterte produkter:

SARS-CoV-2 nukleinsyredeteksjonssett (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)