• PCR er en metode som brukes til å amplifisere DNA fra en liten mengde DNA-template.RT-PCR bruker revers transkripsjon for å produsere en DNA-mal fra en RNA-kilde som deretter kan amplifiseres.
• PCR og RT-PCR er vanligvis endepunktsreaksjoner, mens qPCR og RT-qPCR bruker kinetikken til hastigheten på produktsyntese under PCR-reaksjonen for å kvantifisere mengden av mal som er tilstede.
• Nyere metoder, som digital PCR, gir absolutt kvantifisering av den opprinnelige DNA-malen, mens metoder som isotermisk PCR reduserer behovet for dyrt utstyr for å gi pålitelige resultater.

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en relativt enkel og mye brukt molekylærbiologisk teknikk for å amplifisere og påvise DNA- og RNA-sekvenser.Sammenlignet med tradisjonelle metoder for DNA-kloning og -amplifisering, som ofte kan ta dager, krever PCR bare noen få timer.PCR er svært sensitiv og krever minimalt med mal for deteksjon og amplifikasjon av spesifikke sekvenser.Grunnleggende PCR-metoder har utviklet seg ytterligere fra enkel DNA- og RNA-deteksjon.Nedenfor har vi gitt en oversikt over de forskjellige PCR-metodene og reagensene vi tilbyr hos Enzo Life Sciences for dine forskningsbehov.Vi tar sikte på å hjelpe forskere med rask tilgang til PCR-reagenser som kan brukes i deres neste forskningsprosjekt!

PCR

For standard PCR er alt du trenger en DNA-polymerase, magnesium, nukleotider, primere, DNA-malen som skal amplifiseres og en termosykler.PCR-mekanismen er like enkel som formålet: 1) dobbelttrådet DNA (dsDNA) er varmedenaturert, 2) primere justeres til enkelt-DNA-trådene, og 3) primerne utvides med DNA-polymerase, noe som resulterer i to kopier av original DNA-streng.Denaturerings-, annealings- og forlengelsesprosessen over en rekke temperaturer og tider er kjent som én syklus av amplifikasjon (fig. 1).

Hvert trinn i syklusen bør optimaliseres for malen og primersettet som brukes.Denne syklusen gjentas omtrent 20-40 ganger, og det amplifiserte produktet kan deretter analyseres, typisk med agarosegel (fig. 2).

Siden PCR er en svært sensitiv metode og svært små volumer kreves for enkeltreaksjoner, anbefales det å lage en masterblanding for flere reaksjoner.Hovedblandingen må blandes godt og deretter deles etter antall reaksjoner, for å sikre at hver reaksjon vil inneholde samme mengde enzym, dNTP-er og primere.Mange leverandører, som Enzo Life Sciences, tilbyr også PCR-blandinger som allerede inneholder alt bortsett fra primere og DNA-malen.

Guanin/cytosinrike (GC-rike) regioner representerer en utfordring i standard PCR-teknikker.GC-rike sekvenser er mer stabile enn sekvenser med lavere GC-innhold.Videre har GC-rike sekvenser en tendens til å danne sekundære strukturer, slik som hårnålsløkker.Som et resultat er GC-rike dobbelttråder vanskelige å fullstendig separere under denatureringsfasen.Følgelig kan ikke DNA-polymerase syntetisere den nye tråden uten hindring.En høyere denatureringstemperatur kan forbedre dette, og justeringer mot en høyere annealingstemperatur og kortere annealingstid kan forhindre uspesifikk binding av GC-rike primere.Ytterligere reagenser kan forbedre amplifikasjonen av GC-rike sekvenser.DMSO, glyserol og betain bidrar til å forstyrre de sekundære strukturene som er forårsaket av GC-interaksjoner og dermed lette separasjonen av de doble strengene.

Hot Start PCR

Uspesifikk amplifikasjon er et problem som kan oppstå under PCR.De fleste DNA-polymeraser som brukes til PCR fungerer best ved temperaturer rundt 68°C til 72°C.Enzymet kan imidlertid også være aktivt ved lavere temperaturer, men i lavere grad.Ved temperaturer langt under annealingstemperaturen kan primere binde seg uspesifikke og føre til uspesifikk amplifikasjon, selv om reaksjonen er satt opp på is.Dette kan forhindres ved å bruke polymerasehemmere som dissosierer fra DNA-polymerasen først når en viss temperatur er nådd, derav begrepet varmstart PCR.Inhibitoren kan være et antistoff som binder polymerasen og denaturerer ved den opprinnelige denatureringstemperaturen (vanligvis 95°C).

High Fidelity Polymerase

Mens DNA-polymeraser amplifiserer ganske nøyaktig til den opprinnelige malsekvensen, kan feil i nukleotidmatching oppstå.Feilpasninger i applikasjoner som kloning kan resultere i avkortede transkripsjoner og feiloversatte eller inaktive proteiner nedstrøms.For å unngå disse mismatchene har polymeraser med en "korrekturlesing"-aktivitet blitt identifisert og innlemmet i arbeidsflyten.Den første korrekturlesende polymerasen, Pfu, ble identifisert i 1991 i Pyrococcus furiosus.Dette Pfu-enzymet har en 3' til 5' eksonukleaseaktivitet.Etter hvert som DNA-en amplifiseres, fjerner eksonukleasen feiltilpassede nukleotider i 3'-enden av strengen.Det riktige nukleotidet erstattes deretter, og DNA-syntesen fortsetter.Identifikasjonen av ukorrekte nukleotidsekvenser er basert på bindingsaffiniteten for riktig nukleosidtrifosfat med enzymet, hvor ineffektiv binding bremser syntesen og muliggjør riktig erstatning.Korrekturlesingsaktiviteten til Pfu-polymerase resulterer i færre feil i den endelige sekvensen sammenlignet med Taq DNA-polymerase.De siste årene har andre korrekturlesende enzymer blitt identifisert, og modifikasjoner av det originale Pfu-enzymet er gjort for å redusere feilraten ytterligere under DNA-amplifisering.

RT-PCR

Revers transkripsjon PCR, eller RT-PCR, tillater bruk av RNA som mal.Et ekstra trinn tillater deteksjon og amplifikasjon av RNA.RNA blir revers transkribert til komplementært DNA (cDNA), ved bruk av revers transkriptase.Kvaliteten og renheten til RNA-malen er avgjørende for suksessen til RT-PCR.Det første trinnet i RT-PCR er syntesen av en DNA/RNA-hybrid.Revers transkriptase har også en RNase H-funksjon, som bryter ned RNA-delen av hybriden.Det enkelttrådede DNA-molekylet kompletteres deretter av den DNA-avhengige DNA-polymeraseaktiviteten til revers transkriptasen til cDNA.Effektiviteten til førstestrengsreaksjonen kan påvirke amplifikasjonsprosessen.Fra nå av blir standard PCR-prosedyren brukt til å amplifisere cDNA.Muligheten for å revertere RNA til cDNA ved RT-PCR har mange fordeler, og den brukes først og fremst til genekspresjonsanalyse.RNA er enkelttrådet og svært ustabilt, noe som gjør det utfordrende å jobbe med.Det fungerer vanligvis som et første trinn i qPCR, som kvantifiserer RNA-transkripsjoner i en biologisk prøve.

qPCR og RT-qPCR

Kvantitativ PCR (qPCR) brukes til å oppdage, karakterisere og kvantifisere nukleinsyrer for en rekke bruksområder.I RT-qPCR blir RNA-transkripter ofte kvantifisert ved å revers transkribere dem til cDNA først, som beskrevet ovenfor, og deretter utføres qPCR.Som i standard PCR, blir DNA amplifisert ved tre gjentatte trinn: denaturering, annealing og forlengelse.Imidlertid, i qPCR, muliggjør fluorescerende merking innsamling av data etter hvert som PCR skrider frem.Denne teknikken har mange fordeler på grunn av utvalget av metoder og kjemi som er tilgjengelig.

I fargestoffbasert qPCR (typisk grønn) tillater fluorescerende merking kvantifisering av de amplifiserte DNA-molekylene ved å bruke bruken av et dsDNA-bindende fargestoff.Under hver syklus måles fluorescensen.Fluorescenssignalet øker proporsjonalt med mengden replikert DNA.Derfor kvantifiseres DNA i "sanntid" (fig. 3).Ulempene med fargestoffbasert qPCR er at kun ett mål kan undersøkes om gangen, og at fargestoffet vil binde seg til eventuell ds-DNA som finnes i prøven.

I probebasert qPCR kan mange mål påvises samtidig i hver prøve, men dette krever optimalisering og design av en målspesifikk probe(r) som brukes i tillegg til primere.Flere typer probedesign er tilgjengelige, men den vanligste typen er en hydrolyseprobe, som inneholder en fluorofor og quencher.Fluorescensresonansenergioverføring (FRET) forhindrer utslipp av fluoroforen via quencheren mens sonden er intakt.Under PCR-reaksjonen hydrolyseres imidlertid proben under primerforlengelse og amplifikasjon av den spesifikke sekvensen den er bundet til.Spaltningen av proben skiller fluoroforen fra quencheren og resulterer i en amplifikasjonsavhengig økning i fluorescens (fig. 4).Dermed er fluorescenssignalet fra en probebasert qPCR-reaksjon proporsjonal med mengden av probemålsekvensen som er tilstede i prøven.Fordi probebasert qPCR er mer spesifikk enn fargestoffbasert qPCR, er det ofte teknologien som brukes i qPCR-baserte diagnostiske analyser.

Isoterm forsterkning

PCR-teknikkene som er nevnt ovenfor krever dyrt termosykkelutstyr for nøyaktig å øke og ned kammertemperaturene for denaturerings-, utglødnings- og forlengelsestrinnene.Det er utviklet en rekke teknikker som ikke trenger så nøyaktige enheter og som kan utføres i et enkelt vannbad eller til og med innenfor cellene av interesse.Disse teknikkene kalles samlet isotermisk forsterkning og fungerer basert på eksponentiell, lineær eller kaskadeforsterkning.

Den mest kjente typen isoterm amplifikasjon er loop-mediert isoterm amplifikasjon, eller LAMP.LAMP bruker eksponentiell amplifikasjon ved 65⁰C for å amplifisere mal-DNA eller RNA.Når du utfører LAMP, brukes fire til seks primere komplementære til regioner av mål-DNAet med en DNA-polymerase for å syntetisere nytt DNA.To av disse primerne har komplementære sekvenser som gjenkjenner sekvenser i de andre primerne og binder dem, slik at det kan dannes en "løkke"-struktur i det nylig syntetiserte DNAet som deretter hjelper primer-annealing i påfølgende amplifikasjonsrunder.LAMP kan visualiseres ved hjelp av flere metoder, inkludert fluorescens, agarosegelelektroforese eller kolorimetri.Enkelheten av å visualisere og oppdage tilstedeværelse eller fravær av produkt ved kolorimetri og mangelen på kostbart utstyr som kreves, gjorde LAMP til et passende alternativ for SARS-CoV-2-testing i områder der klinisk laboratorietester ikke var lett tilgjengelig, eller lagring og transport av prøver ikke var mulig, eller i laboratorier som ikke tidligere hadde PCR-termosyklingutstyr.