Alle snakker om prinsippet for qRT-PCR-eksperiment, primerdesign, resultattolkning osv., men jeg tror jeg bør dele med deg den eksperimentelle driften av qRT-PCR.Det er lite, men det handler om resultater.
Før vi gjør qRT-PCR, må vi ha en klar forståelse av vårt eget RNA og operasjonsmetoder.Tross alt er vår innsats rettet mot å oppnå resultater, i stedet for å bare øve.Så før vi gjør qRT-PCR, må vi bestemme følgende problemer (hvorav noen bare gjelder for SYBR).
1 Er du sikker på at RNA-et ditt ikke er nedbrutt?
NanoDrop 2000 kan bare oppdage konsentrasjonen og renheten til RNA, men kan ikke oppdage integriteten til RNA.
RNA-verdien (RNA-intesitetsnummer) kan gjenspeile integriteten til RNA, som detekteres av Agilent 2100 Bioanalyzer-systemet.
Fig. Skjematisk diagram av RIN-verdier for forskjellige RNA-prøver (eukaryoter)
Imidlertid har laboratorier generelt ikke Agilent 2100 Bioanalyzer.I dette tilfellet kan vi detektere gjennom formaldehydgel, men kravet til den totale mengden RNA er høyt, så den raskeste metoden er å bruke vanlig gelelektroforese.Det kreves å være i et nukleasefritt miljø, så det er nødvendig å skylle elektroforesetanken, solflasken, gelbraketten og kammen med DEPC-vann.Agarosen er også nukleasefri (så lenge den er nyåpnet), og Loading Buffer bør være nyåpnet så mye som mulig, med 1,2 % gel.
Merk at gelen må være fullstendig oppløst, ellers vil den forårsake inhomogene bånd, som vist i prøve 9 i figuren.Hvis spenningen er for høy eller kjører for lenge, vil det generere varme og forårsake RNA-nedbrytning, så spenningen og tiden bør kontrolleres rimelig.I tillegg kan gelkjøring også avgjøre om det er DNA-rester i prøven, og observere om det er et stort antall beholdte bånd i dispenseringsbrønnen.
Figur.Gelelektroforesedeteksjon av RNA
2 Er du sikker på konsentrasjonen av cDNA?
Erfaringen til storebrødrene i laboratoriet er at cDNA til 20 ul-systemet som oppnås ved hver inversjon blir direkte fortynnet 20X, mens postdoktorsøstrene fortynnes 10X.Jeg er vanligvis avhengig av situasjonen.Fordi kvaliteten på RNA nevnt av hver person er forskjellig, er nivået av reversering også forskjellig, og reverseringsteknologien er kanskje ikke stabil.
Så hver gang jeg får det reverserte cDNA, vil jeg først fortynne det omtrent 3 ganger, og deretter bruke housekeeping-genet til å gjøre RT-PCR, antall sykluser er vanligvis 25 sykluser, for å identifisere den spesifikke konsentrasjonen, og deretter bestemme den endelige fortynningsfaktoren.
3 Er du sikker på at primerne er enkle å bruke?
Den kan passere smeltekurven til qRT-PCR, men dette koster fortsatt penger.For laboratorier uten mye penger, når de får mange primere, kan de bruke vanlig RT-PCR for å se om det er et enkelt bånd og identifisere spesifisiteten til primerne.Hvis laboratoriet ikke mangler penger, kan spesifisiteten til alle primere identifiseres én gang gjennom smeltekurven.
4 Er du sikker på at dine eksperimentelle forhold er passende?
SYBR bør beskyttes mot sterkt lys, så prøv å slå av lyset når du legger til SYBR-reagens, og trenger bare å bruke dempet lys for å fullføre det.
Oppbevar SYBR ved 4°C.Når den er i bruk, vend den forsiktig opp og ned for å blande godt for å unngå skum, og ikke vortex kraftig.
Noen yngre søstre liker å tegne merker på PCR-tavlen i frykt for å blande sammen prøvene, noe som er feil.Fordi markørene dine med stor sannsynlighet vil påvirke innsamlingen av fluorescerende signaler, anbefaler jeg generelt juniorer å bruke eksperimentelle notatbøker for å hjelpe til med hukommelsen, som vist nedenfor.
Figur.qRT-PCR prøveinnlastingsdiagram
5 Er du sikker på at du gjør det riktig?
Sørg for å bruke hansker, bruk hansker, bruk hansker og si viktige ting tre ganger.
For å redusere eksponeringen av SYBR for lys, liker jeg personlig å legge til en mal først, som vist i figuren under.Erfaringsmessig vil tilsetning av en liten mengde mal sannsynligvis forårsake prøvetakingsfeil.Derfor, for å minimere feilen forårsaket av å legge til en liten mengde mal, dobler jeg vanligvis prøven igjen, og dobler mengden når jeg legger til prøven for å redusere mengden H2O2 som tilsettes.
Figur.Skjematisk diagram av QRT-PCR-lasting
Konfigurer deretter qRT-PCR-systemet som følger.
Figur.qRT-PCR-system klargjøringsdiagram
MERK: Konfigurasjonsprosessen må gjøres på is.
Etter å ha tilsatt prøven, lim inn den gjennomsiktige forseglingsfilmen.Prøv å ikke berøre overflaten av den gjennomsiktige forseglingsfilmen med hendene, bare bruk fra rommet på begge sider av filmen.Fordi fingeravtrykk også kan påvirke innsamlingen av fluorescerende signaler.Bruk deretter en sentrifuge for å raskt sentrifugere i 10 s ved lav hastighet for å forhindre at prøven henger på veggen.
Relaterte produkter:
Innleggstid: 28. april 2023
