COVID-19 er en smittsom sykdom forårsaket av alvorlig akutt luftveissyndrom Coronavirus Type 2. Når en person er smittet, er de vanligste symptomene feber, hoste og kortpustethet.

Prøvene som brukes til testing kan tas med nasofaryngeale vattpinner eller orofaryngeale vattpinner.

Hva er PCR?

Standardmetoden for koronavirusdeteksjon er polymerasekjedereaksjon, PCR.Dette er en metode som er mye brukt i molekylærbiologi.Den kan raskt kopiere millioner til milliarder av spesifikke DNA-fragmenter.

Det nye koronaviruset inneholder et veldig langt enkelttrådet RNA-genom.For å oppdage disse virusene ved PCR, må RNA-molekyler omdannes til deres komplementære DNA-sekvenser ved hjelp av revers transkriptase, og deretter kan det nylig syntetiserte DNA amplifiseres ved standard PCR-prosedyrer, som vanligvis er kjent som RT-PCR.

RT-PCR prosess

RNA-ekstraksjon

For å utføre denne metoden bør viralt RNA i utgangspunktet ekstraheres.En rekke RNA-rensesett kan brukes for praktisk, rask og effektiv separasjon.

For å ekstrahere viralt RNA ved hjelp av et kommersielt sett, legg først prøven til et mikrosentrifugerør og bland den deretter med lyseringsbufferen.Denne bufferen er sterkt denaturert og består vanligvis av fenol og guanidin isotiocyanat.I tillegg er RNase-hemmere vanligvis tilstede i lyseringsbufferen for å sikre isolering av intakt viralt RNA.

Etter tilsetning av lyseringsbufferen, vortex blanderøret med puls og inkuber ved romtemperatur.Viruset lyseres deretter under sterkt denaturerende forhold gitt av lyseringsbufferen.

Etter at prøven er lysert, brukes et sentrifugerør for renseprosedyren.Prøven settes inn i sentrifugerøret og sentrifugeres deretter.

Denne prosedyren er en fastfaseekstraksjonsmetode der den stasjonære fasen består av en silikagelmatrise.

Under optimale salt- og pH-forhold binder RNA-molekyler seg til silikamembranen.

Samtidig fjernes protein og andre forurensninger.

Etter sentrifugering setter du sentrifugerøret i et rent oppsamlingsrør, kaster filtratet og tilsett deretter vaskebuffer.

Plasser røret i sentrifugen igjen for å tvinge vaskebufferen gjennom membranen.Dette vil fjerne alle gjenværende urenheter fra membranen, og etterlate bare RNA bundet til silikagelen.

Etter at prøven er vasket, sett røret inn i et rent mikrosentrifugerør og tilsett elueringsbufferen.

Den sentrifugeres deretter for å tvinge elueringsbufferen gjennom membranen.Elueringsbufferen fjerner viralt RNA fra spinnkolonnen og oppnår renset RNA fri for proteiner, inhibitorer og andre forurensninger.

STEG 2

Blandet konsentrat

Etter ekstrahering av det virale RNA, er neste trinn å forberede reaksjonsblandingen for PCR-amplifisering.I dette trinnet brukes konsentrat.Denne konsentrerte løsningen er en forhåndsblandet konsentrert løsning som består av en forhåndsblanding, revers transkriptase, nukleotider, forward primer, revers primer, TaqMan-probe og DNA-polymerase.

Til slutt, for å fullføre denne reaksjonsblandingen, tilsettes RNA-malen.Rørene blandes ved pulsvortexing, og deretter lastes reaksjonsblandingen inn i PCR-platen.PCR-platen inneholder vanligvis 96 brønner og kan analysere flere prøver samtidig.

TRINN 3

PCR-amplifikasjon

Deretter plasserer du platen i PCR-maskinen, som egentlig er en termisk syklus.

Sanntids RT-PCR brukes til å oppdage det nye koronaviruset fra 2019 ved å forsterke målsekvensen i RdrRP-genet, E-genet og N-genet.Valget av målgen avhenger av primeren og probesekvensen.

Det første trinnet i RT-PCR er revers transkripsjon.Den første tråden av komplementært DNA syntetiseres, som initieres av PCR-reversprimeren, som binder seg til den komplementære delen av det virale RNA-genomet.Deretter legger revers transkriptase til DNA-nukleotider til 3'-enden av primeren for å syntetisere DNA komplementært til det virale RNA.Temperaturen og varigheten av dette trinnet avhenger av primerne, mål-RNA og revers transkriptase som brukes.

Deretter påføres et første denatureringstrinn, som resulterer i denaturering av RNA-DNA-hybriden.Dette trinnet er nødvendig for å aktivere DNA-polymerasen.Samtidig inaktiveres revers transkriptase.

PCR består av en serie termiske sykluser.Hver syklus består av denaturerings-, annealing- og forlengelsestrinn.

Denatureringstrinnet innebærer å varme opp reaksjonskammeret til 95 grader Celsius og bruke det til denaturering av den dobbelttrådete DNA-malen.

I neste trinn reduseres reaksjonstemperaturen til 58 grader Celsius, slik at den fremre primeren kan anneale til den komplementære delen av sin enkelttrådede DNA-mal.Glødetemperaturen avhenger direkte av lengden og sammensetningen av primeren.

I forlengelsestrinnet syntetiserer DNA-polymerasen en ny DNA-streng som er komplementær til DNA-templatetråden.Ved å legge til frie kjerner som er komplementære til malen i 5′ til 3′-retningen fra reaksjonsblandingen.Temperaturen på dette trinnet avhenger av DNA-polymerasen som brukes.

Etter den første syklusen oppnås et dobbelttrådet DNA-mål.

Gå deretter inn i den andre syklusen.Det dobbelttrådete DNA denatureres for å produsere to enkelttrådede DNA-molekyler.

I neste trinn senkes reaksjonstemperaturen, primerne anneales til hver enkelttrådet DNA-template, og Taq-man-proben anneales til den komplementære delen av mål-DNA.

TaqMan-proben består av en fluorofor kovalent koblet til 5'-enden av oligonukleotidproben.Når den eksiteres av lyskilden til sykluseren, avgir fluoroforen fluorescens.I tillegg er sonden sammensatt av en quencher i 3′enden.Nærheten til reportergenet til quencheren forhindrer påvisning av fluorescens.

I forlengelsestrinnet syntetiserer DNA-polymerasen en ny tråd.Når polymerasen når TaqMan-proben, spalter dens endogene 5'nukleaseaktivitet proben, og skiller fargestoffet fra quencheren.

Med hver PCR-syklus frigjøres flere fargestoffmolekyler, noe som resulterer i en økning i fluorescensintensitet proporsjonal med antall syntetiserte amplikoner.

Denne metoden gjør det mulig å estimere antallet av en gitt sekvens som er tilstede i prøven.Antall dobbelttrådete DNA-fragmenter dobles i hver syklus.Derfor kan PCR brukes til å analysere svært små prøver.

For måling av fluorescerende signal, wolfram halogenlampe, eksitasjonsfilter, reflektor, linse, emisjonsfilter og ladekoblet enhet-bruk CCD-kamera.

TRINN 4 Oppdag

For måling av fluorescerende signal, wolfram halogenlampe, eksitasjonsfilter, reflektor, linse, emisjonsfilter og ladekoblet enhet-bruk CCD-kamera.

Det filtrerte lyset fra lampen reflekteres av reflektoren, passerer gjennom kondensatorlinsen og fokuseres til midten av hvert hull.Deretter reflekteres fluorescensen som sendes ut fra hullet fra speilet, passerer gjennom emisjonsfilteret og oppdages av CCD-kameraet.I hver PCR-syklus kan det selveksiterte fluoroforlyset detekteres av CCD.

Den konverterer det fangede lyset til digitale data.Denne metoden kalles sanntids-PCR, og den tillater sanntidsovervåking av fremdriften av PCR-reaksjonen.