Flere revolusjonerende oppfinnelser i deteksjonsteknologiens historie i mitt sinn er immunmerkingsteknologi basert på prinsippet om antigen-antistoff-spesifikk binding, PCR-teknologi og sekvenseringsteknologi.I dag skal vi snakke om PCR-teknologi.I henhold til utviklingen av PCR-teknologi deler folk vanligvis PCR-teknologi i tre generasjoner: vanlig PCR-teknologi, sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-teknologi og digital PCR-teknologi.
Cvanlig PCR-teknikk
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis oppfant polymerasekjedereaksjonen (polymerase chain reaction , PCR) i 1983. Det sies at da han kjørte kjæresten sin, fikk han plutselig et glimt av inspirasjon og tenkte på PCR-prinsippet (om fordelene ved å kjøre bil).Kary Mullis ble tildelt Nobelprisen i kjemi i 1993. New York Times kommenterte: «Svært original og betydningsfull, nesten deler biologi i pre-PCR og post-PCR epoker.
Prinsippet for PCR: Under katalyse av DNA-polymerase brukes moderstreng-DNA som mal, og den spesifikke primeren brukes som utgangspunkt for forlengelse, og datterstreng-DNA som er komplementær til moderstreng-template-DNA kopieres in vitro gjennom denaturering, annealing, forlengelse og andre trinn.Det er en DNA-syntese-amplifikasjonsteknologi in vitro, som raskt og spesifikt kan amplifisere ethvert mål-DNA in vitro.
Fordeler med vanlig PCR
1.Klassisk metode, komplette internasjonale og nasjonale standarder
2.Lavere pris på instrumentreagenser
3.PCR-produkter kan gjenvinnes for andre molekylærbiologiske eksperimenter
Anbefalt Foregene PCR-maskin: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Relaterte produkter: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Ulemper med vanlig PCR
1.lett å forurense
2.tungvint drift
3.kun kvalitativ analyse
4.Moderat følsomhet
5.Det er ikke-spesifikk forsterkning, og når det ikke-spesifikke båndet har samme størrelse som målbåndet, kan det ikke skilles fra hverandre
Capillær elektroforesebasert PCR
Som svar på manglene ved vanlig PCR har noen produsenter introdusert instrumenter basert på prinsippet om kapillærelektroforese.Elektroforesetrinnet etter PCR-amplifisering er fullført i kapillæren.Følsomheten er høyere, og forskjellen på flere baser kan skjelnes og forsterkningen kan beregnes av MAERKER.produktinnhold.Ulempen er at PCR-produktet fortsatt må åpnes og settes inn i instrumentet, og det er fortsatt stor risiko for kontaminering.
CapillærEelektroforese
2. Sanntidsfluorescerende kvantitativ PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) teknologiFluorescerende kvantitativ PCR, også kalt Real-Time PCR, er en ny kvantitativ nukleinsyreteknologi utviklet av PE (Perkin Elmer) i 1995. Utviklingshistorien til fluorescerende kvantitativ PCR er en historie med sjelerørende kamper fra giganter som ABI, Roche og Bio-Rad.Hvis du er interessert, kan du sjekke det ut.Denne teknikken er for tiden den mest modne og mest brukte semi-kvantitative PCR-teknikken.
Anbefalt qPCR-maskin: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescerende fargemetode (SYBR Green I):SYBR Green I er det mest brukte DNA-bindende fargestoffet for kvantitativ PCR, som binder seg uspesifikt til dobbelttrådet DNA.I fri tilstand avgir SYBR Green svak fluorescens, men når den er bundet til dobbelttrådet DNA, øker fluorescensen 1000 ganger.Derfor er det totale fluorescerende signalet som sendes ut av en reaksjon proporsjonalt med mengden dobbelttrådet DNA tilstede og vil øke med økningen av amplifisert produkt.Siden fargestoffet binder seg uspesifikt til dobbelttrådet DNA, kan det genereres falske positive resultater.
Relaterte produkter: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescerende sondemetode (Taqman-teknologi): UnderPCR-amplifisering, en spesifikk fluorescerende probe tilsettes samtidig som et par primere.Proben er et lineært oligonukleotid, med henholdsvis en fluorescerende reportergruppe og en fluorescerende quencher-gruppe merket i begge ender.Når proben er intakt, absorberes det fluorescerende signalet som sendes ut av reportergruppen av quencher-gruppen, og deteksjonen Det er ikke noe fluorescerende signal;under PCR-amplifisering (i forlengelsesstadiet), vil 5'-3' Dicer-aktiviteten til Taq-enzymet fordøye og degradere proben, slik at reporterfluorescensgruppen og quencher-fluorescensgruppen separeres, slik at fluorescensovervåkingssystemet. Det fluorescerende signalet kan mottas, det vil si hver gang en DNA-kjede akkumuleres for å akkumulere fluorescensen av fluorescerende molekyl, hvilken fluorescerende molekyl forsterkes. ulering av fluorescerende signaler og dannelse av PCR-produkter.Taqman-sondemetoden er den mest brukte deteksjonsmetoden i klinisk deteksjon.
Relaterte produkter: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Fordeler med qPCR
1.Metoden er moden og støtteutstyret og reagensene er komplette
2.Middels kostnad for reagenser
3.lett å bruke
4.Høy deteksjonssensitivitet og spesifisitet
Ulemper med qPCR
Mutasjonen av målgenet fører til savnet deteksjon.
Deteksjonsresultatet av mal med lav konsentrasjon kan ikke bestemmes.
Det er stor feil ved bruk av standardkurven for kvantitativ deteksjon.
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) teknologi
Digital PCR er en teknikk for absolutt kvantifisering av nukleinsyremolekyler.Sammenlignet med qPCR kan digital PCR direkte lese antall DNA/RNA-molekyler, som er den absolutte kvantifiseringen av nukleinsyremolekyler i startprøven.I 1999 foreslo Bert Vogelstein og Kenneth W. Kin-zler formelt konseptet dPCR.
I 2006 var Fluidigm den første som produserte et kommersielt chipbasert dPCR-instrument.I 2009 lanserte Life Technologies OpenArray og QuantStudio 12K Flex dPCR-systemene.I 2013 lanserte Life Technologies QuantStudio 3DdPCR-systemet, som bruker mikrofluidisk brikketeknologi med høy tetthet i nanoskala for å jevnt fordele prøver til 20 000 individuelle celler.i reaksjonsbrønnen.
I 2011 lanserte Bio-Rad det dråpebaserte QX100 dPCR-instrumentet, som bruker vann-i-olje-teknologi for å fordele prøven jevnt til 20 000 dråper-vann-i-olje, og bruker en dråpeanalysator for å analysere dråpene.I 2012 lanserte RainDance RainDrop dPCR-instrumentet, drevet av høytrykksgass, for å dele opp hvert standard reaksjonssystem i en reaksjonsemulsjon som inneholder 1 million til 10 millioner mikrodråper på pikoliternivå.
Så langt har digital PCR dannet to hovedfraksjoner, brikketype og dråpetype.Uansett hva slags digital PCR, er kjerneprinsippene begrenset fortynning, endepunkt-PCR og Poisson-distribusjon.Standard PCR-reaksjonssystemet som inneholder nukleinsyremaler er jevnt delt inn i titusenvis av PCR-reaksjoner, som distribueres til sjetonger eller mikrodråper, slik at hver reaksjon inneholder så mye som mulig et templatmolekyl, og det utføres en enkeltmolekyltemplate-PCR-reaksjon.Ved å lese av fluorescensen telles tilstedeværelsen eller fraværet av signalet, og den absolutte kvantifiseringen utføres etter kalibrering av den statistiske Poisson-fordelingen.
Følgende er egenskapene til flere digitale PCR-plattformer jeg har brukt:
1. Bio-Rad QX200 dråpe digital PCR Bio-RadQX200 er en veldig klassisk digital PCR-plattform, den grunnleggende deteksjonsprosessen: 20 000 prøver genereres av dråpegeneratoren Vann-i-olje mikrodråper forsterkes på en vanlig PCR-maskin, og til slutt leses fluorescenssignalet til hver mikrodråpe av en mikrodråpeleser.Operasjonen er mer komplisert, og risikoen for forurensning er middels.
Xinyi TD1 mikrodråpe digital PCRXinyi TD1 er en innenlandsk digital PCR-plattform, den grunnleggende deteksjonsprosessen: generer 30 000-50 000 vann-i-olje-dråper gjennom en dråpegenerator, forsterk på et vanlig PCR-instrument og passer til slutt. Dråpeleseren leser det fluorescerende signalet til hver dråpe.Både generering av dråper og avlesning i denne plattformen utføres i en dedikert brikke med lav risiko for kontaminering.
STILLA Naica mikrodråpebrikke digital PCRSTILLA Naica er en relativt ny digital PCR-plattform.Den grunnleggende deteksjonsprosessen er: legg reaksjonsløsningen til brikken, legg brikken inn i mikrodråpegenererings- og amplifikasjonssystemet og generer 30 000 mikrodråper.Spres på brikken, og PCR-amplifisering er fullført på brikken.Deretter overføres den forsterkede brikken til analysesystemet for mikrodråpelesing, og det fluorescerende signalet leses ved å ta bilder.Siden hele prosessen foregår i en lukket brikke, er risikoen for forurensning lav.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D-brikke digital PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D er en annen klassisk brikkebasert digital PCR-plattform.Dens grunnleggende deteksjonsprosess er: tilsett reaksjonsløsningen i sprederen, og spred reaksjonsløsningen jevnt på brikken med 20 000 mikrobrønner gjennom sprederen., sett brikken på PCR-maskinen for å forsterke, og sett til slutt brikken inn i leseren og ta et bilde for å lese det fluorescerende signalet.Operasjonen er relativt komplisert, og hele prosessen utføres i en lukket brikke, og risikoen for forurensning er lav.
5. JN MEDSYS Clarity chip digital PCR
JN MEDSYS Clarity er en relativt ny chip-type digital PCR-plattform.Dens grunnleggende deteksjonsprosess er: legg reaksjonsløsningen inn i applikatoren, og fordel reaksjonsløsningen jevnt på 10 000 PCR-rør festet i PCR-røret gjennom applikatoren.På den mikroporøse brikken kommer reaksjonsløsningen inn i brikken gjennom kapillærvirkning, og PCR-røret med brikken plasseres på PCR-maskinen for amplifisering, og til slutt settes brikken inn i leseren for å lese av det fluorescerende signalet ved å ta et bilde.Operasjonen er mer komplisert.Risikoen for forurensning er lav.
Parametrene til hver digital PCR-plattform er oppsummert som følger:
Evalueringsindikatorene for den digitale PCR-plattformen er: antall delte enheter, antall fluorescerende kanaler, kompleksiteten i driften og risikoen for kontaminering.Men det viktigste er deteksjonsnøyaktigheten.En måte å evaluere digitale PCR-plattformer på er å bruke flere digitale PCR-plattformer for å verifisere hverandre, og en annen måte er å bruke standardstoffer med nøyaktige verdier.
Fordeler med dPCR
1.Oppnå absolutt kvantifisering
2.Høyere sensitivitet og spesifisitet
3.Kan oppdage prøver med lavt antall kopier
Ulemper med dPCR1. Dyrt utstyr og reagenser 2. Komplisert drift og lang deteksjonstid 3. Smal deteksjonsområde
For tiden har de tre generasjonene med PCR-teknologi sine egne fordeler og ulemper, og hver har sine egne bruksområder, og det er ikke et forhold at den ene generasjonen erstatter den andre.Den kontinuerlige utviklingen av teknologi har injisert ny vitalitet i PCR-teknologien, slik at den kan låse opp den ene applikasjonsretningen etter den andre, noe som gjør nukleinsyredeteksjon mer praktisk og nøyaktig.
Kilde: Dr. Yuan tar deg med for testing
Anbefalte produkter:
Innleggstid: 18. november 2022
