1. Påvis absorbansen til RNA-løsning
Absorbans ved 280, 320, 230 og 260 nm representerer verdiene av henholdsvis nukleinsyre, bakgrunn (oppløsningsturbiditet), saltkonsentrasjon og organisk materiale som protein.Se vanligvis bare på OD260/OD280 (forhold, R).Når 1,8~2,0, tror vi at forurensning av protein eller annet organisk materiale i RNA kan tolereres, men det bør bemerkes at når Tris brukes som buffer for å oppdage absorbansen, kan R-verdien være større enn 2 (vanligvis bør den være <2,2).Når R<1,8 er forurensning av protein eller annet organisk materiale i løsningen mer åpenbar, og skjebnen til RNA kan bestemmes i henhold til behovene.Når R>2.2 betyr det at RNA har blitt hydrolysert til enkeltnukleinsyre.
2. Elektroforetisk mønster av RNA
Vanligvis brukes denaturerende gel til RNA-elektroforese, men hvis det kun er for å påvise kvaliteten på RNA, er denaturerende gel ikke nødvendig, og vanlig agarosegel kan brukes.Formålet med elektroforese er å oppdage integriteten til 28S- og 18S-bånd og deres forhold, eller integriteten til mRNA-utstryk.Generelt, hvis 28S- og 18S-båndene er lyse, klare og skarpe (med henvisning til at kantene på båndene er klare), og lysstyrken til 28S er mer enn det dobbelte av 18S-båndet, anser vi at kvaliteten på RNA er god.
Ovennevnte er de to metodene vi vanligvis bruker, men ingen av disse to metodene kan tydelig fortelle oss om det er gjenværende RNase i RNA-løsningen.Hvis det er en veldig liten mengde RNase i løsningen, er det vanskelig for oss å oppdage det med metoden ovenfor, men de fleste av de påfølgende enzymatiske reaksjonene utføres ved over 37 grader og i lang tid.På denne måten, hvis det er en veldig liten mengde RNase i RNA-løsningen, vil det være et meget passende miljø og tid til å spille sin rolle i de påfølgende eksperimentene, og selvfølgelig vil eksperimentet være kaldt på dette tidspunktet.Nedenfor introduserer vi en metode som kan bekrefte om det er gjenværende RNase i RNA-løsningen.
3. Varmekonserveringstest
I henhold til prøvekonsentrasjonen, trekk to 1000 ng RNA fra RNA-løsningen og tilsett det til et 0,5 ml sentrifugerør, og suppler det med pH 7,0 Tris-buffer til et totalt volum på 10 ul, og forsegl deretter lokket på røret.Sett en av dem i et vannbad med konstant temperatur ved 70°C og hold den varm i 1 time.Den andre delen ble lagret i et -20°C kjøleskap i 1 time.Når tiden er ute, fjern de to prøvene for elektroforese.Etter at elektroforesen er fullført, sammenligne de elektroforetiske båndene til de to.Hvis båndene til de to er konsistente eller ikke har noen signifikant forskjell (selvfølgelig oppfyller båndene deres også betingelsene i metode 2), betyr det at det ikke er gjenværende RNase-kontaminering i RNA-løsningen, og kvaliteten på RNA er meget god.Tvert imot, hvis prøven inkubert ved 70 °C viser åpenbar nedbrytning, indikerer det at det er RNase-kontaminering i RNA-løsningen.
2 Eksperimentelle metoder og teknikker for RNA-ekstraksjon
Problemene vi ofte møter når vi ekstraherer RNA er: (1) RNA-utbyttet er lavt;(2) RNA har alvorlig saltforurensning;(3) RNA har alvorlig organisk løsningsmiddelforurensning;(4) prøvenedbrytning og andre problemer
1. Vanlig brukte total-RNA-ekstraksjonsreagenser
Guanidinisotiocyanatmetoden og Trizolmetoden er de mest brukte metodene for ekstraksjon av totalt RNA fra dyrevev og dyreceller.Den er spesielt egnet for små prøver og vev som er spesielt vanskelige å trekke ut, for eksempel ekstraksjon av totalt RNA fra kaninhud og dyrebindevev;i tillegg kan Trizol, som et lysereagens for generell bruk, også brukes til ekstraksjon av plantevev, bakterier, sopp og annet vev.For plantevev som inneholder polysakkarider og polyfenoler, som for eksempel camellia oleifera, teblader, raps, etc., kan CTAB-metoden også brukes til å ekstrahere totalt RNA.
Som en konvensjonell metode er dobbeltkolonnemetoden også veldig populær på grunn av normal temperaturdrift, ingen behov for å tilsette RNase og sikkerhet - ingen kloroform, fenoler og andre organiske reagenser for ekstraksjon.(anbefalte produkter )
2. Ekstraksjon av totalt RNA fra dyrevev
(1) Prøv å velge ferskt vev, hvis det ikke er ferskt (helst innen tre måneder - 80 ℃ kjøleskap eller frosset i flytende nitrogen. Når du skjærer vev, ikke skjær direkte ved romtemperatur, pass på å Sett det på isboksen, prøv å unngå gjentatt frysing og tining.
(2) Bruk en ren saks og pinsett til å kutte et lite stykke vev, prøv å kutte den sentrale delen av vevet når du skjærer prøven, eller klipp først det store stykket vev fra midten, og skjær deretter prøven i den ferske snittposisjonen.Det fjernede vevet skal være fullstendig strimlet, legg det strimlede vevet inn i et EP-rør uten RNase, tilsett lysatet, det strimlede vevet skal være fullstendig eksponert for lysatet, og forberede homogenisering.
(3) For normalt vev, velg vev på størrelse med mungbønne (30-60 mg) for homogenisering.Hvis vevene inneholder en stor mengde protein, fett eller tett fibrøst vev som lever, øk eller reduser mengden kuttet vev på passende måte (valgfritt) Velg 10~20 mg).
(4) Hvis fiskemuskler, rekekjøtt, maneter og annet vev med høyt vanninnhold ekstraheres, bør prøvevolumet økes passende (anbefalt 100-200 mg).
(5) Hvis forholdene tillater det, kan dyrevevet ekstraheres direkte etter å ha blitt homogenisert med en høypassasjevevshomogenisator, dersom det ikke finnes slikt utstyr.
(6) RNA oppnådd etter den endelige ekstraksjonen må plasseres på isboksen umiddelbart for å redusere nedbrytningen av RNA.
3. Dyrecelle-RNA-ekstraksjon
(1) Suspensjonsceller: sentrifuger direkte og kast mediet, vask med steril PBS i 1-2 ganger, suspender deretter med en passende mengde PBS, og tilsett lysat for lysering.Ikke tilsett lysatet direkte til de utfelte cellene etter å ha kastet væsken fullstendig.Dette vil føre til at histonpakken som frigjøres etter de lyserte cellene på det ytre laget fester seg til utsiden av de utfelte cellene, og begrenser dermed kontakten mellom cellene inne i pelleten og lysatet., noe som resulterer i ufullstendig cellelyse og redusert RNA-utbytte.
(2) Celler som er semi-adherent eller ikke tett vedheftende: Etter å ha kastet mediet, vask med PBS i 1-2 ganger, absorber deretter en passende mengde PBS direkte og blås kulturskålen med en pipette eller pistol for å blåse av cellene, og overføre dem til RNA-frie celler.Legg lysatet til EP-røret til enzymet for ekstraksjon.
(3) Adherente celler: må først fordøyes med trypsin, deretter samles i RNase-frie EP-rør, sentrifugeres for å fjerne supernatanten, vaskes 1-2 ganger med PBS for å fjerne overflødig trypsin, og resuspenderes med en passende mengde PBS Fortsett deretter til ekstraksjonstrinnet.
4. Plante-RNA-ekstraksjon
Plantevev er rike på fenoliske forbindelser, eller rike på polysakkarider, eller inneholder noen uidentifiserte sekundære metabolitter, eller har høy aktivitet av RNase.Disse stoffene er tett kombinert med RNA etter cellelyse for å danne uløselige komplekser eller kolloidale bunnfall, som er vanskelige å fjerne.Derfor, når vi trekker ut plantevev, må vi velge et sett for planter.Lysatet i settet kan effektivt løse problemene med enkel oksidasjon av polyfenoler og separasjon av polysakkaridforbindelser og nukleinsyrer.
(For polysakkarid polyfenol plante RNA ekstraksjon, anbefalte produkter:
(1) Skallet, fruktkjøttet, frøene, bladene osv. av planten bør males helt i en morter.Under maleprosessen bør flytende nitrogen fylles på i tide for å unngå smelting av prøven.Den malte prøven bør raskt tilsettes til lysatet og ristes for å unngå RNA-nedbrytning.
(2) For fiberrike prøver som ris og hveteblader bør ekstraksjonsmengden reduseres på passende måte, ellers vil vevsmaling og lysering ikke være fullstendig, noe som resulterer i lavt utbytte av ekstrahert RNA.
(3) For plantevev med høyt vanninnhold, som granateplefrukt, vannmelonfrukt, ferskenfrukt osv., bør prøvestørrelsen økes på passende måte (100-200 mg er valgfritt).
(4) Plantevev, som planteblader, jordstengler, harde frukter og andre materialer anbefales generelt å bruke flytende nitrogen for å mørte ingrediensene grundig i en morter, og deretter fortsette til ekstraksjonstrinnet.Konvensjonelle vevshomogenisatorer er kanskje ikke effektive til å homogenisere plantevev, og anbefales generelt ikke.
5. Forholdsregler for RNA-ekstraksjon
(1) Vevsprøver bør være så ferske som mulig for å unngå gjentatt frysing og tining.
(2) Vevet bør være helt malt under ekstraksjonen, og mengden vev bør ikke være for lite, enn si for mye.
(3) Tilstrekkelig inkubasjonstid bør gis etter tilsetning av lysatet for å lysere prøven fullstendig.
(4) Ved bruk av Trizol-metoden for ekstraksjon er prinsippet om å absorbere supernatanten etter stratifisering "foretrekker å inhalere mindre enn inhalere mer", og må ikke trekkes ut til mellomlaget, ellers vil det forårsake alvorlig genomisk DNA-forurensning.
(5) Ved vask skal vaskevæsken infiltrere helt rundt rørveggen for å sikre grundig vask.
(6) For kolonneekstraksjonsmetoden, i tillegg til å løsne kolonnen etter vask, bør adsorpsjonskolonnen også plasseres i en ultra-ren benk og blåses i 5-10 minutter for å fullstendig fordampe det organiske løsningsmidlet til tørrhet.
(7) Ved siste eluering av kolonnemetoden, etter tilsetning av DEPC-vann, bør det inkuberes i 3-5 minutter, eller DEPC-vannet bør varmes opp til 60°C på forhånd for å øke elueringsutbyttet.I den tradisjonelle Trizol-spaltnings- og isopropanolutfellingsmetoden løses det endelige RNA i DEPC-vann, så det bør gis en passende tid for oppløsning, og bunnen av sentrifugerøret skal blåses kontinuerlig med en pipettespiss.
3 Ttre årsaker og løsninger for lav RNA-konsentrasjon/dårlig kvalitet
1. Utbyttet er for lavt
Den ekstraherte prøven er for lav, den totale mengden er utilstrekkelig, eller den ekstraherte prøven er for mye og lyseringen er ikke fullstendig;vevet eller cellene av passende kvalitet bør brukes til ekstraksjon, forbehandlingen av prøven må gjøres godt, og lyseringen bør være tilstrekkelig.
2. Genomrester
Ved ekstrahering med Trizol-metoden, når supernatanten suges inn i mellomlaget etter lagdeling, vil det oppstå alvorlig genomforurensning;ekstra forsiktighet bør utvises ved lagdeling for å unngå å suge inn i mellomlaget.Hvis kolonnemetoden brukes for ekstraksjon, kan et sett som inneholder DNase I velges for ekstraksjon.Nukleinsyren som er adsorbert på membranen fordøyes direkte med DNase I, noe som i stor grad kan redusere DNA-rester.
3. RNA-nedbrytning
Det kan være nedbrytningen av selve den ekstraherte prøven, eller nedbrytningen forårsaket under ekstraksjonsprosessen;Så langt det er mulig bør ferske prøver brukes til RNA-ekstraksjon, og de innsamlede prøvene bør oppbevares i flytende nitrogen eller -80°C kjøleskap i tide, og gjentatt frysing og tining bør unngås.RNase/DNase-frie spisser, sentrifugerør og andre materialer bør brukes i RNA-ekstraksjonsprosessen.Utvinningsprosessen bør være så rask som mulig.Det ekstraherte RNA bør plasseres på en isboks og lagres ved -80 i tid.Hvis det ekstraherte RNA må påvises ved gelelektroforese, bør elektroforese utføres umiddelbart etter ekstraksjon, og elektroforesebufferen bør erstattes med en nylig forberedt.
4. Salt og organiske løsemiddelrester
Ekstraksjonsreagensene inneholder fenol- og guanidinsalter, og vaskeløsningen inneholder etanol.Under ekstraksjonsprosessen ble ikke lysatet fullstendig absorbert og kastet, og vaskeløsningen ble ikke helt tørket.Restsalter og organiske løsemidler er skadelige for påfølgende revers transkripsjon og PCR.Ulike grader av inhibering, så vevslysatet bør fjernes fullstendig under ekstraksjonsprosessen, og vaskingen bør være tilstrekkelig slik at de omkringliggende veggene i røret kan vaskes.I tillegg tømmes røret og blåsing er et nødvendig skritt, noe som vil redusere rester av organisk materiale ytterligere.
For mer informasjon om RNA-ekstraksjon, følg vår nettside:
www.foreivd.com for mer informasjon.
Innleggstid: Des-01-2022
