Molekylær diagnoseteknologi bruker molekylærbiologiske metoder for å oppdage uttrykket og strukturen til det genetiske materialet til menneskekroppen og ulike patogener, for å oppnå formålet med å forutsi og diagnostisere sykdommer.

De siste årene, med oppgradering og iterasjon av molekylær diagnostisk teknologi, har den kliniske anvendelsen av molekylær diagnostikk blitt mer og mer omfattende og dyptgående, og markedet for molekylær diagnostikk har gått inn i en periode med rask utvikling.

Forfatteren oppsummerer de vanlige molekylærdiagnostiske teknologiene på markedet, og er delt inn i tre deler: den første delen introduserer PCR-teknologien, den andre delen introduserer den isotermiske amplifikasjonsteknologien for nukleinsyre, og den andre delen introduserer sekvenseringsteknologien.

01

Del I: PCR-teknologi

PCR-teknologi

PCR (polymerasekjedereaksjon) er en av in vitro DNA-amplifikasjonsteknologiene, med en historie på mer enn 30 år.

PCR-teknologi ble utviklet i 1983 av Kary Mullis fra Cetus, USA.Mullis søkte om et PCR-patent i 1985 og publiserte den første PCR-akademiske artikkelen om vitenskap samme år.Mullis vant Nobelprisen i kjemi i 1993.

Grunnleggende prinsipper for PCR

PCR kan amplifisere mål-DNA-fragmenter med mer enn én million ganger.Prinsippet er at under katalyse av DNA-polymerase, brukes moderstreng-DNA som en mal, og en spesifikk primer brukes som utgangspunkt for forlengelse.Det replikeres in vitro gjennom trinn som denaturering, annealing og forlengelse.Prosessen med datterstreng-DNA som er komplementær til stamtråd-DNA.

Standard PCR-prosessen er delt inn i tre trinn:

1. Denaturering: Bruk høy temperatur for å skille DNA-dobbeltråder.Hydrogenbindingene mellom DNA-dobbeltråder brytes ved høye temperaturer (93-98°C).

2. Annealing: Etter at dobbelttrådet DNA er separert, senkes temperaturen slik at primeren kan binde seg til enkelttrådet DNA.

3. Forlengelse: DNA-polymerasen begynner å syntetisere komplementære tråder langs DNA-trådene fra primerne bundet når temperaturen senkes.Når utvidelsen er fullført, fullføres en syklus, og antallet DNA-fragmenter dobles.

Ved å gjengjelde disse tre trinnene 25-35 ganger, vil antallet DNA-fragmenter øke eksponentielt.

Oppfinnsomheten med PCR er at ulike primere kan designes for ulike målgener, slik at målgenfragmentene kan amplifiseres i løpet av kort tid.

Så langt kan PCR deles inn i tre kategorier, nemlig ordinær PCR, fluorescerende kvantitativ PCR og digital PCR.

Den første generasjonen av vanlig PCR

Bruk et vanlig PCR-amplifikasjonsinstrument for å amplifisere målgenet, og bruk deretter agarosegelelektroforese for å oppdage produktet, kun kvalitativ analyse kan gjøres.

De viktigste ulempene med første generasjons PCR:

- Utsatt for uspesifikk amplifikasjon og falske positive resultater.

-Deteksjonen tar lang tid og operasjonen er tungvint.

-Kun kvalitativ testing kan gjøres.

Andre generasjons fluorescens kvantitativ PCR

Fluorescens kvantitativ PCR (Real-Time PCR), også kjent som qPCR, brukes til å overvåke akkumulering av amplifiserte produkter gjennom akkumulering av fluorescerende signaler ved å legge til fluorescerende prober som kan indikere fremdriften til reaksjonssystemet, og for å bedømme resultatene gjennom fluorescenskurven, og den kan kvantifiseres med standardkurveverdi og standardkurveverdi.

Fordi qPCR-teknologien utføres i et lukket system, reduseres sannsynligheten for kontaminering, og fluorescenssignalet kan overvåkes for kvantitativ deteksjon, så det er den mest brukte i klinisk praksis og har blitt den dominerende teknologien innen PCR.

De fluorescerende stoffene som brukes i sanntids fluorescerende kvantitativ PCR kan deles inn i: TaqMan fluorescerende prober, molekylære beacons og fluorescerende fargestoffer.

1) TaqMan fluorescerende sonde:

Under PCR-amplifisering tilsettes en spesifikk fluorescerende probe mens du legger til et par primere.Proben er et oligonukleotid, og de to endene er henholdsvis merket med en reporter-fluorescerende gruppe og en quencher-fluorescerende gruppe.

Når proben er intakt, absorberes det fluorescerende signalet som sendes ut av reportergruppen av quenching-gruppen;under PCR-amplifisering spalter og bryter 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq-enzymet proben, noe som gjør reporteren til fluorescerende gruppe og quencher. Den fluorescerende gruppen separeres, slik at fluorescensovervåkingssystemet kan motta fluorescenssignalet, det vil si hver gang en DNA-tråd blir akkumulert for fluorescerende molekyler og fluoreserer. cence-signalet er fullstendig synkronisert med dannelsen av PCR-produktet.

2) SYBR fluorescerende fargestoffer:

I PCR-reaksjonssystemet tilsettes et overskudd av SYBR fluorescerende fargestoff.Etter at SYBR-fluorescerende fargestoff er ikke-spesifikt inkorporert i DNA-dobbeltstrengen, sender det ut et fluorescerende signal.SYBR-fargestoffmolekylet som ikke er inkorporert i kjeden vil ikke sende ut noe fluorescerende signal, og dermed sikre det fluorescerende signalet Økningen i PCR-produkter er fullstendig synkronisert med økningen i PCR-produkter.SYBR binder seg kun til dobbelttrådet DNA, så smeltekurven kan brukes til å bestemme om PCR-reaksjonen er spesifikk.

3) Molekylære beacons

Det er en stilkløkke dobbeltmerket oligonukleotidprobe som danner en hårnålsstruktur på omtrent 8 baser i de 5 og 3 endene.Nukleinsyresekvensene i begge ender er komplementært paret, noe som fører til at den fluorescerende gruppen og den slokkende gruppen er tette.Lukk, det vil ikke produsere fluorescens.

Etter at PCR-produktet er generert, under annealingsprosessen, blir den midtre delen av det molekylære beacon paret med en spesifikk DNA-sekvens, og det fluorescerende genet separeres fra quencher-genet for å produsere fluorescens.

De viktigste ulempene med andre generasjons PCR:

Følsomheten mangler fortsatt, og deteksjonen av prøver med lite kopier er ikke nøyaktig.

Det er bakgrunnsverdipåvirkning, og resultatet er mottakelig for forstyrrelser.

Tredje generasjons digital PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) beregner kopitallet til målsekvensen gjennom endepunktdeteksjon, og kan utføre nøyaktig absolutt kvantitativ deteksjon uten å bruke interne kontroller og standardkurver.

Digital PCR bruker endepunktdeteksjon og er ikke avhengig av Ct-verdien (syklusterskel), så den digitale PCR-reaksjonen påvirkes mindre av amplifikasjonseffektiviteten, og toleransen for PCR-reaksjonshemmere er forbedret, med høy nøyaktighet og reproduserbarhet.

På grunn av egenskapene til høy følsomhet og høy nøyaktighet, blir det ikke lett forstyrret av PCR-reaksjonshemmere, og det kan oppnå ekte absolutt kvantifisering uten standardprodukter, som har blitt et forsknings- og applikasjonshotspot.

I henhold til de forskjellige formene for reaksjonsenheten kan den deles inn i tre typer: mikrofluid-, chip- og dråpesystemer.